该研究发表于mycological progress期刊，第24卷第90期，于2025年12月13日在线发表。研究题为“new dung‑inhabiting ascomycetes from germany extend diversity in parascedosporium and scytalidium, including updated descriptions of two collariella species”，由来自德国布伦瑞克感染研究中心、布伦瑞克工业大学微生物学研究所等机构的Karen Harms、Paomephan Pathompong、Christiane Baschien和Yasmina Marin‑Felix合作完成。

学术背景与研究目的 本研究隶属于真菌学中的分类学与生物多样性领域，重点关注粪生真菌这一生态类群。真菌是地球上仅次于昆虫的第二大生物类群，目前描述的真菌物种约有14-15万种，但据估计总数可能高达220-380万种，表明仍有大量未知物种有待发现。粪生真菌，特别是以草食动物粪便为基质的腐生真菌，作为一种研究相对较少的独特生境，被认为蕴藏着丰富的真菌多样性，是发现新分类单元的潜在宝库。然而，以往对粪生真菌的研究多集中在少数几个国家，且鉴定主要依赖于形态学特征。近几十年的研究表明，许多属内物种由于形态特征相似或重叠，仅凭形态学难以准确界定，例如Bipolaris和Curvularia等属。因此，结合分子序列数据和形态学特征的多相分类研究对于揭示粪生真菌的真实多样性至关重要。近年来，此类研究在从粪便中分离的Alternaria、Cladosporium、Penicillium等属中已成功发现多个新物种，甚至新属，进一步证实了粪便作为真菌新物种来源的价值。本研究正是在此背景下，旨在探索德国莱尔地区采集的草食动物粪便中的真菌多样性。通过多相分类学方法，研究目标不仅包括鉴定分离到的真菌，更期望能够发现和描述新的物种，并对已有物种的分类学描述进行更新和补充。具体目标包括：报道德国粪生真菌中的新物种，对相关属（如Parascedosporium）进行首次多基因座分析以验证其物种界限，并对形态相似的近缘物种（如Collariella属的成员）进行基于分子数据的精确界定。

详细研究流程 本研究遵循了标准的多相分类学研究流程，涵盖了样本采集、分离培养、表型研究、分子研究（DNA提取、多基因座扩增与测序）和系统发育分析等环节。

1. 样品采集与真菌分离

   • 研究材料与样本量：研究团队从德国莱尔埃塞霍夫动物园的圈养动物中采集了两种草食动物的粪便样本：矮山羊粪和黇鹿粪。
   • 实验方法：采用经典的湿室培养法进行粪生真菌的分离。样品在室温（23°C）下培养，使用体视显微镜观察长达2个月。使用无菌针头将目标真菌的孢子挑取至添加了青霉素、链霉素（抑制细菌）和伊维菌素（抑制螨虫和线虫）的酵母麦芽琼脂培养基上，并在室温下培养以获得纯化菌株。

2. 表型研究

   • 研究材料：根据初步鉴定结果，将分离得到的菌株按其所属属（Collariella、Parascedosporium、Scytalidium）分组进行培养和形态学观察。包括C. carteri的一个分离株（DSM 115395）、C. pachypodioides的模式株（CBS 164.52）、两个疑似为新种的Parascedosporium菌株（CBS 150083, YMF 29）和一个疑似为新种的Scytalidium菌株（CBS 150082）。
   • 实验方法：
     • 培养特征：根据前人研究建议，在不同培养基上（如燕麦琼脂OA、马铃薯胡萝卜琼脂PCA、麦芽提取物琼脂MEA等）和不同温度（5-40°C）下培养，记录菌落形态、颜色、生长速率及最适生长温度。颜色标准依据皇家园艺学会比色卡。
     • 显微形态：将产孢结构（子囊壳、分生孢子梗等）置于乳酸（这些属的标准制片液）中制片，使用Keyence和Nikon显微镜进行测量和显微照相。
     • 方法特殊性：本研究并未发明新的实验方法，但严格按照各属公认的、可重复的标准培养和观察条件进行操作，确保了结果的可靠性和可比性。

3. 分子研究

   • 研究材料：对分离得到的疑似新分类群菌株及相关参考菌株（从全球保藏中心获取的模式菌株，如Parascedosporium putredinis、P. tectonae、Rhinocladium lesnei的模式株）进行DNA提取。
   • 实验方法：
     • DNA提取与PCR扩增：使用商业试剂盒从YM琼脂平板上的菌落中直接提取基因组DNA。根据真菌类群不同，PCR扩增多个DNA条形码基因座：
       • 通用区域：所有分类群均扩增内转录间隔区和核糖体大亚基28S rDNA的D1–D3结构域。
       • 属特异性区域：
         • Collariella：额外扩增β-微管蛋白基因和RNA聚合酶II第二亚基基因。
         • Parascedosporium：额外扩增钙调蛋白基因和β-微管蛋白基因。
         • Scytalidium：额外扩增RNA聚合酶II第二亚基基因。
     • 测序与序列处理：扩增产物纯化后，使用桑格测序法测序，并用Geneious®软件拼接获得一致性序列。本研究新产生的序列已提交至GenBank数据库。
     • 系统发育分析：共进行了三项独立的系统发育分析，分别对应Collariella、Parascedosporium和Scytalidium三个属。
       • 序列比对与数据集构建：使用MAFFT软件对各基因座序列分别进行比对，并在MEGA软件中手动调整。检查各单基因树是否存在冲突后，将不同基因的数据集串联。
       • 建树方法：采用最大似然法和贝叶斯推断法构建系统发育树。ML分析在CIPRES门户网站上使用RAxML完成。最佳进化模型由MrModeltest确定后用于BI分析。自举支持率 ≥ 70% 和后验概率 ≥ 0.95 被视为具有显著支持。

主要研究结果 1. Collariella属的研究结果： * 从黇鹿粪中分离到一株Chaetomium-like真菌。基于ITS、LSU、RPB2和TUB2四个基因座序列的系统发育分析表明，该菌株与C. carteri的模式株（CBS 128.85）聚为一支（支持率：99% BS/1 PP），并且与C. capillicompacta的模式株也位于同一高度支持的支系内。 * 原C. carteri的鉴别特征是具短而刚毛状的孔口周围毛。然而，本次分离株（DSM 115395）却显示出螺旋卷曲的毛。因此，研究人员修正了C. carteri的物种描述，将这一形态变异（包括C. capillicompacta所描述的卷曲毛特征）纳入。同时，研究确认C. capillicompacta是C. carteri的同物异名，其形态差异不具有系统发育学意义。 * 研究还提供了其最近缘物种C. pachypodioides（模式株CBS 164.52）的现代形态描述和图解，这是该物种自1945年描述以来的首次详细图示。研究表明，C. carteri与C. pachypodioides在形态上无法区分，必须依赖分子数据进行物种界定。研究首次在欧洲报道了C. carteri，并将其来源拓展至粪便。

1. Parascedosporium属的研究结果：

   • 从羊驼粪中分离到两株产生Graphium-like菌丝束的菌株。基于ITS、LSU、CAL和TUB2四基因座的系统发育分析显示，这两个菌株与已知的P. putredinis模式株不在同一支系，而是形成一个独立的、支持良好的分支，表明属于一个新物种，被命名为Parascedosporium germanicum。
   • 该分析同时证实了基于单ITS序列提出的P. putredinis、P. tectonae和Rhinocladium lesnei之间的同物异名关系（均归并为P. putredinis），这是首次通过多基因座分析对此进行验证。
   • P. germanicum与P. putredinis在形态上的主要区别在于：能产生更长的菌丝束（长达1 mm vs. 最长450 µm）以及更长的分生孢子。
   • 分析还发现，Scedosporium sanyaense的模式株与P. putredinis聚在同一支持率不高的支系中，两者ITS序列相似度高达99.82%，提示可能为同一物种，但需更多基因座数据确认，因此本研究暂未对其归属进行调整。

2. Scytalidium属的研究结果：

   • 从平原斑马粪中分离到一株仅产生厚垣孢子、不产生节分生孢子的菌株。
   • 基于ITS和LSU序列的系统发育分析表明，该菌株位于Scytalidium属（模式种S. lignicola所在支系）内，但处于一个独立的进化分支，表明属于一个新物种，被命名为Scytalidium essehofinum。
   • 该分析与S. cuboideum和S. sphaerosporum亲缘关系最近。S. essehofinum是三者中唯一仅产厚垣孢子且不产节分生孢子的。与同样仅产厚垣孢子的S. assmuthi相比，需依靠序列数据才能准确区分。
   • 系统发育分析还揭示，当前归在Scytalidium属下的许多物种，与Mycothermus thermophilus（属子囊菌门粪壳菌纲）聚在一起，暗示这些分类单元可能需要从Scytalidium属（属锤舌菌纲）中移出，重新归入粪壳菌纲或其他适当的属。

结论与意义 本研究的核心结论是通过对德国一处小型草食动物粪便样本的深入研究，成功发现了真菌的两个新物种（Parascedosporium germanicum 和 Scytalidium essehofinum），并修正和更新了Collariella属内两个近缘物种（C. carteri 和 C. pachypodioides）的分类学描述。 其科学价值主要体现在：1. 丰富生物多样性认知：证明了即使在德国这样真菌学研究较为深入的国家，粪便这一特定生境依然能发现新的真菌物种，凸显了真菌的巨大多样性和未充分探索的生态位。2. 推动分类学进展：采用多相分类学方法，澄清了物种界限（如确认C. carteri与C. capillicompacta为异名，证实P. putredinis的异名关系），建立了可靠的分子条形码体系（如首次对Parascedosporium进行多基因座分析），并为形态相似的物种提供了分子鉴定的必要性案例。3. 揭示分类学混乱：揭示了Scytalidium属当前的分类学混乱状况，指出了许多物种基于形态学被错误归类的可能性，为后续的分类修订奠定了基础。 其应用价值：粪生真菌因其在竞争性环境（粪便）中生存，被认为是次生代谢产物的丰富来源，这些化合物可能作为化学防御物质。成功分离和鉴定这些真菌，为后续发掘具有抗菌或其他生物活性的天然产物（如药物先导化合物）提供了宝贵的菌种资源。 研究者呼吁，未来应加强对粪生真菌多样性研究的投入，特别是在非洲大陆等被忽视的地区，以更全面地揭示全球真菌多样性。

研究亮点 1. 重要的新发现：从有限的采样中发现了两个完全新的真菌物种，并报道了属的新记录，显示出粪便生境中隐藏的、可快速获得的分类学新发现潜力。 2. 方法论的新颖性与严谨性：系统性地应用多相分类学工作流程，尤其突出体现在首次对Parascedosporium属进行多基因座系统发育分析，解决了仅凭ITS序列可能存在的分类学不确定性。对近缘种（C. carteri和C. pachypodioides）采用分子数据作为界定标准的强调，具有很好的示范意义。 3. 研究对象的特殊性：专注于相对研究不足的粪生真菌群落，拓展了对特定生态功能群真菌多样性的认知边界。同时，研究揭示了传统形态分类在Scytalidium等属中遇到的挑战，具有普遍性意义。 4. 整合性贡献：不仅描述新物种，还整合了分类学修订（C. carteri描述修正）、模式材料再研究（C. pachypodioides的现代描述与图示）和属级系统发育澄清（Scytalidium的潜在分类问题），提供了全面、深入的信息。

其他有价值内容 本研究的数据可获得性良好，所有新生成的序列已提交至GenBank，系统发育分析所用的比对文件作为补充材料提供，符合开放科学的原则，便于其他研究者验证和进一步研究。