这是一篇类型a的文献，以下为报告内容：
作者与发表信息
本文的主要作者为anjali mahilkar、namratha raj、sharvari kemkar以及supreet saini，其中通讯作者为supreet saini。研究团队隶属于印度理工学院孟买分校化学工程系（department of chemical engineering, indian institute of technology bombay）。该研究于2022年发表于《scientific reports》期刊，文章标题为《selection in a growing colony biases results of mutation accumulation experiments》，doi编号为10.1038/s41598-022-19928-5。
学术背景
本研究属于进化遗传学与微生物实验进化领域。突变积累实验（mutation accumulation experiment，ma实验）是估计突变率、突变适应性效应分布（distribution of fitness effects，dfe）以及突变谱的关键方法。经典ma实验的设计原理是：让单个创始个体通过反复的严重瓶颈传代生长，使自然选择的作用被最小化，从而记录接近“中性”条件下随机发生的突变。在细菌和酵母中，ma实验通常通过在固体琼脂平板上反复挑取菌落并转接来完成。已有研究表明，ma实验得到的平均适应度会随着转接次数增加而下降，且不同独立品系间适应度方差增大。
然而，在菌落生长阶段，选择真的可以被忽略吗？以往认为，由于几乎一半的细胞分裂（以及相应突变）发生在最后一代，瓶颈在选择产生作用之前就被施加了，因此选择效应极低。但本文作者指出，这个假设主要建立在定性直觉上，缺乏定量验证。作者观察到，他们自己进行的大肠杆菌ma实验中，许多品系适应度不但没有下降，反而高于祖先，这促使他们系统研究菌落生长过程中选择对ma实验结果的影响。该研究旨在定量证明：在微生物ma实验中，菌落生长阶段的选择作用会显著偏离真实的突变分布，导致对突变率和dfe的估计产生偏倚。
研究流程
本研究包含数学建模、计算机模拟和大肠杆菌ma实验三大部分。
1. 数学模型与菌落生长模拟
作者首先构建了一个包含两个阶段的菌落生长模型。第一阶段为随机生长阶段：从单一单倍体祖先细胞开始，模拟至60,000个个体的群体大小。祖先细胞分裂时间设定为100分钟。每次分裂，子代以概率(1-\mu)与母体基因型相同，以概率(\mu)获得一个新突变；突变有益的概率为(b)，有害的概率为(1-b)，中性突变被忽略。有益与有害突变的效应均从指数分布中抽取，参数分别为(\lambda_b)和(\lambda_d)。突变后子代的分裂时间根据效应大小更新。在每个时间步，模型识别距离下次分裂最近的个体并使其分裂，同时更新其他细胞的剩余分裂时间。
第二阶段为确定性生长阶段：从60,000个个体开始，模型采用耦合常微分方程组来追踪各适应度区间（bin）内个体数量的变化。每过一个世代，每个bin中会产生(n\mu)个新突变个体，其适应度效应按照预先设定的指数分布进行分配。有益和有害突变体分别加入相应bin。模型使用matlab的ode45求解，直至群体达到菌落的最大承载量(k)。在标准条件下，(k)设为(6\times10^8)，转移时菌落大小设为(10^8)，(b)设为0.05。
为模拟ma实验，研究者在一个菌落生长至指定大小后，从所有个体中随机挑选一个个体作为下一轮的创始者。该随机挑选的概率与各基因型在菌落中的频率成正比。此过程重复2000次转接。对照组模拟中，突变虽被记录，但不改变细胞表型，所有细胞的分裂速率与祖先相同。
为了检验不同参数的影响，研究者系统改变了(b)（有益突变比例）、转移时菌落大小、环境承载量(k)以及突变率(\mu)。他们还测试了有害突变分布为正态、均匀或混合正态分布时，结果是否会改变。
2. 大肠杆菌ma实验
作者进行了两组ma实验。第一组包含22个大肠杆菌品系，在lb平板上转接80次，用于观察早期适应度变化趋势。第二组为大规模验证实验，包含160个平行品系，分为五组，每组32个品系：小菌落组（s1-s32，生长8小时）、中等菌落组（m1-m32，生长12小时）、大菌落组（l1-l32，生长24小时）、大菌落边缘组（e1-e32，从菌落外缘挑取细胞转接）和大菌落中心组（c1-c32，从菌落中心挑取细胞转接）。所有品系均转接150次，每50次转接后保存样本。
适应度测量通过液体lb培养基中的生长速率来估计：从冻存样本复苏后，转接到96孔板中，在37°c下用微孔板读数仪（tecan infinite m200 pro）每30分钟记录od600，直至到达稳定期，计算相对生长速率。为了检验菌落不同区域的选择压力差异，作者还进行了热胁迫实验（50°c水浴1小时）和溶剂胁迫实验（10%乙醇处理10分钟），比较边缘组和中心组品系在胁迫后的菌落形成单位（cfu）存活率。
3. 数据分析
在模拟数据中，作者计算了每个菌落中携带有益和有害突变个体数量的比值（(n_b/n_d)），比较了“有选择”与“无选择”条件下该比值的分布。对dfe的估计，采用最大似然法将观测到的突变效应分布拟合为指数分布，得到(\lambda)参数，并与理论底层分布比较。此外，通过扫描(\mu)和(b)的二维参数空间，寻找能够解释模拟ma适应度下降轨迹的参数组合。对实验数据，使用未配对双尾t检验比较各组平均适应度的差异，使用levene检验比较方差差异，使用kolmogorov-smirnov检验比较分布差异。
主要结果
1. ma实验中适应度增加现象
在22个品系、80次转接的实验中，尽管22个品系的平均生长率下降，但其中10个品系在40次转接时出现了生长率的增加。到80次转接时，仍有7个品系的适应度高于祖先。在所有统计显著的测量点中，约45%显示适应度增加，55%显示下降。这一比例与通常认为的有害突变远多于有益突变的观点不符，提示选择可能在菌落生长阶段产生了作用。
2. 菌落生长中的选择效应
模拟单菌落结构显示，当存在选择时，携带不同适应度效应的细胞频率分布与“无选择”对照组有显著差异。在1000个模拟菌落的(n_b/n_d)比值分布中，选择使该比值相比无选择预期（约0.05）增加了约20%。说明即使在一个菌落的短暂生长期间，选择已经足以改变有益与有害突变的相对丰度。
3. 模拟ma实验的适应度轨迹
在2000次转接的模拟中，有选择条件下平均适应度随时间下降，但下降轨迹与无选择对照有统计显著差异。早期有大量品系适应度高于祖先，随着转接数增加，这类品系比例降低。不同品系间适应度方差随转接数增加而增大。值得注是，由于选择使得部分品系保留了较高的适应度水平，有选择条件下品系间行为在一定阶段内比无选择对照更加均一，但在更长时期内方差反而更大，因为不同品系沿着不同的适应性路径演化。
4. dfe估计的偏倚
模拟结果显示，有益突变在ma实验中被显著过度代表。根据菌落大小的不同，观察到的有益突变百分比从约20%增加到约33%，远高于模拟设定的底层比例(b=0.05)。对于dfe的估计，从ma实验观测到的有益突变分布拟合得到的(\lambda)为1.26，而底层理论值为1.0；有害突变分布拟合值为3.13，底层理论值为3.0。这说明有害突变的dfe可以从ma实验中较准确地估计，但有益突变的dfe估计则存在明显偏差。作者还进一步指出，由于(\mu)和(b)之间存在耦合，仅凭ma实验的适应度轨迹无法唯一确定突变率，使得从ma实验估计(\mu)变得复杂。
5. 不同实验设计的影响
有益突变比例(b)越高，平均适应度下降越慢。转移时菌落大小同样影响结果：小菌落转移时适应度下降最慢，大菌落转移时最快。当转移菌落大小固定时，环境承载量(k)对结果影响不大；但如果每次都在群体达到(k)时才转移，不同(k)值下的ma轨迹显著不同。突变率增高会加速适应度下降。作者还发现，如果以细胞分裂次数（doublings）而非转接次数为横坐标，不同菌落大小条件下的适应度轨迹差异会消失，但当变量为突变率或有益突变比例时，这种差异依然存在。此外，改变有害突变分布的假设（正态、均匀、混合正态）并不影响定性结果。
6. 实验验证
在160个品系、150次转接的实验中，小、中、大菌落组的平均适应度均随转接数下降，但下降速率不同：大菌落组下降最快，小菌落组最慢。第50次转接时，小菌落组与大菌落组的平均适应度差异不显著（(p>0.24)），但其他所有两两比较在50、100和150次转接时均达到统计显著（(p<0.001)）。在比较边缘组、中心组和全菌落组时，边缘组的平均生长率最高，中心组最低，全菌落组介于两者之间。这证明了菌落不同微环境中的选择压力不同。在胁迫实验中，中心组品系在热胁迫和溶剂胁迫后的存活率均显著高于边缘组（热胁迫(p<0.00001)，溶剂胁迫(p<10^{-15})），这与中心区域细胞长期暴露于营养和溶剂胁迫、从而获得了更高的胁迫耐受性一致。
结论与意义
本研究定量证明了在微生物ma实验中，菌落生长阶段的选择作用会显著影响实验结果。有益突变被过度代表，有害突变被低估，dfe估计存在定量偏差，突变率估计变得非平凡。因此，此前基于ma实验得到的突变率、突变谱和dfe参数需要重新审视。该研究的意义在于，它并不否定ma实验的价值，而是指出在解释ma实验结果时必须考虑选择作用的贡献。在应用层面，该研究提示实验设计（如菌落大小、转移时机、取样位置）会系统影响ma实验的结果，这对于未来突变研究的设计和标准化具有重要指导意义。
研究亮点
本研究的亮点在于：（1）首次通过定量模拟和实验相结合的方式，系统证明了菌落生长阶段选择对ma实验结果的偏倚效应；（2）揭示了ma实验的适应度轨迹与多个参数之间的复杂关系，特别是(\mu)与(b)的耦合使得突变率估计不可唯一确定；（3）实验上直接证明菌落不同空间位置（边缘与中心）的细胞受到不同选择压力，并能影响后续的胁迫耐受性演化。这些发现挑战了ma实验中选择作用可忽略的传统假设，为微生物突变研究提供了新的理论框架。