本研究由 Hizlan H. Agus、Cemaynur Sarp 和 Meryem Cemiloglu 共同完成，三位作者均来自土耳其伊斯坦布尔新纪元大学分子生物学与遗传学系。该研究成果发表于 Toxicology Research 期刊，于 2018 年 4 月 26 日在线发表，文献 DOI 为 10.1039/c8tx00100f。

本研究属于分子毒理学与细胞死亡研究领域。萜品油烯（terpinolene）是一种广泛存在于松科植物精油中的单萜类化合物，常被用作食品添加剂、化妆品香料及制药工业中的气味剂。尽管已有研究表明萜品油烯在体外和体内具有一定的细胞毒性、抗增殖活性及抗癌潜力，但其诱导程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）的具体机制尚不清楚。以往关于萜品油烯毒性的研究主要集中在大鼠、部分植物、植物害虫及植物病原真菌上，在模式真菌中的毒性机制仍缺乏系统性的实验数据。裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe（粟酒裂殖酵母）是分子毒理学和细胞死亡研究中重要的单细胞真核模式生物，其细胞周期调控、线粒体生物发生以及程序性细胞死亡通路与哺乳动物细胞高度保守，因此被选为本研究的实验模型。本研究旨在评估萜品油烯对裂殖酵母细胞增殖、细胞活力及凋亡的影响，并进一步探究氧化应激、线粒体损伤及 DNA 损伤在其中的分子机制。

研究流程主要包括五个部分：毒性测试与细胞增殖活力评估、凋亡形态学检测、活性氧水平测定与抗氧化酶基因表达分析、线粒体跨膜电位检测以及凋亡相关基因表达分析。在毒性测试中，研究者使用野生型裂殖酵母菌株 SP972h⁻，在标准 YEL 培养基中培养至对数期后，将细胞重悬于不同浓度的萜品油烯溶液中（0–800 mg/L）处理 3 小时，以三氧化二砷作为阳性对照。通过血细胞计数板评估细胞增殖抑制情况，并使用亚甲蓝染色法检测细胞死亡率。结果显示，细胞增殖抑制率呈浓度依赖性增加，IC50 值为 349 mg/L，LC50 值为 593 mg/L。与人类外周血淋巴细胞中报道的较低毒性浓度相比，裂殖酵母中萜品油烯的半数致死浓度较高，研究者认为这可能与酵母细胞壁的刚性结构及其相对不透性有关。

在凋亡检测环节，研究者采用吖啶橙/溴化乙锭双染法和 DAPI 染色法观察细胞核形态。吖啶橙可进入所有细胞并呈现绿色荧光，而溴化乙锭只能进入细胞膜完整性丧失的细胞并呈现橙红色荧光。荧光显微镜观察显示，在 200–800 mg/L 萜品油烯处理组中均可观察到早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞，细胞核出现染色质凝集和碎裂等典型凋亡形态。定量统计表明，在 600 mg/L 浓度下凋亡细胞比例达到 39.85%，接近该浓度下的死亡率 47.53%；在 800 mg/L 时凋亡率与死亡率几乎一致，分别为 75.52% 和 77.12%，表明高浓度下细胞死亡以凋亡为主要形式。DAPI 染色进一步证实了处理组中细胞核呈现点状或新月形的凝集形态，与文献报道的凋亡特征一致。

在氧化应激分析中，研究者使用 DCFDA 荧光染色法和 NBT 还原法测定细胞内活性氧水平。DCFDA 可自由透过细胞膜，在细胞内被活性氧氧化为荧光产物 DCF，荧光强度与活性氧水平正相关。结果显示，随着萜品油烯浓度从 200 mg/L 增加到 800 mg/L，绿色荧光强度呈剂量依赖性升高，约增加 1.5–2 倍。NBT 还原实验进一步验证了这一结果，在 200–600 mg/L 浓度范围内 NBT 还原程度显著增加，在 800 mg/L 时还原量增加超过两倍，表明超氧阴离子生成显著上升。与此同时，抗氧化酶基因表达分析显示，超氧化物歧化酶基因 sod1 和谷胱甘肽过氧化物酶基因 gpx1 的 mRNA 水平在 400–600 mg/L 浓度范围内显著上调 2–3 倍，但在 800 mg/L 时出现回落。研究者认为，抗氧化酶基因表达的上调通常与活性氧水平升高相关，是对氧化应激的代偿性响应；而在 800 mg/L 时的表达回落可能与过高活性氧导致的细胞大量死亡有关。

在线粒体跨膜电位检测中，研究者采用罗丹明 123 染色法。罗丹明 123 可被具有完整线粒体膜电位的线粒体富集，荧光强度的下降可反映线粒体膜电位的丧失。结果显示，在 200–800 mg/L 萜品油烯处理组中，罗丹明 123 荧光强度呈剂量依赖性降低，尤其在 600 mg/L 和 800 mg/L 浓度下荧光强度下降至少 2 倍，提示线粒体功能受到严重损伤。研究者指出，线粒体膜电位的耗散与凋亡发生密切相关，高水平的活性氧可能通过改变线粒体膜通透性而导致线粒体功能障碍，而线粒体损伤又可进一步促进活性氧的产生，形成正反馈循环，最终引发细胞凋亡。

在凋亡相关基因表达分析中，研究者通过实时荧光定量 PCR 检测了 pca1 和 sprad9 的 mRNA 水平。pca1 是裂殖酵母中的半胱天冬酶同源基因，被认为在凋亡过程中发挥作用，但其具体功能仍有争议。sprad9 与人类 RAD9 同源，参与 DNA 损伤应答。实验结果显示，pca1 在 400 mg/L 萜品油烯处理时表达量显著增加约 2 倍，但在 600 mg/L 和 800 mg/L 时表达水平回落至未处理细胞水平。sprad9 在 600 mg/L 时表达量显著升高，提示该浓度下发生了较严重的 DNA 损伤。值得注意的是，在 3 mM 三氧化二砷阳性对照组中，pca1 和 sprad9 的表达量均增加 4–5 倍，进一步证明了这两个基因在凋亡过程中的重要作用。

综合以上实验结果，研究者得出以下结论：萜品油烯能够显著抑制裂殖酵母细胞增殖并降低细胞活力，其细胞毒性作用主要通过诱导细胞凋亡实现；萜品油烯诱导的细胞凋亡与氧化应激水平升高和线粒体跨膜电位降低密切相关。这是首次在裂殖酵母中系统阐明萜品油烯诱导凋亡机制的研究。该研究的意义在于：一方面，利用裂殖酵母这一遗传背景清晰、操作简便且与哺乳动物细胞在凋亡通路和线粒体功能上高度保守的模式生物，为萜品油烯的毒性机制研究提供了重要的实验依据；另一方面，由于酵母细胞具有与癌细胞相似的代谢特征，该研究也为萜品油烯作为潜在抗癌药物候选物的风险评估和作用机制解析提供了基础数据。此外，研究还指出，除凋亡外，萜品油烯是否能够诱导自噬和脂毒性细胞死亡等其他程序性细胞死亡方式仍需进一步研究，这为后续工作指明了方向。

本研究的亮点在于：首次在单细胞真核模式生物裂殖酵母中系统研究了萜品油烯诱导细胞凋亡的分子机制；将细胞活力、凋亡形态学、氧化应激、线粒体功能和凋亡相关基因表达等多个层面的数据整合起来，形成较为完整的毒性机制证据链；并且采用多种互补的实验方法相互验证，例如用 DCFDA 荧光法和 NBT 还原法共同评价活性氧水平，用吖啶橙/溴化乙锭双染和 DAPI 染色共同证实凋亡形态特征。这些方法学的组合使用提高了结果的可靠性，也为后续以酵母为模型评估其他单萜类化合物毒性提供了可借鉴的实验流程。