本项研究发表于学术期刊nucleic acids research 2025年第53卷。主要作者为来自中国南京农业大学三亚研究院、作物遗传与种质创新利用国家重点实验室、江苏省植物基因组编辑工程研究中心等单位的Zheng Li、Wei Zhao、Shaokang Li、Xi Luo、Yinghui Wei（以上五位为并列第一作者），以及通讯作者Junjie Tan。合作单位还包括西北农林科技大学、南京农业大学植物病理学系以及德国马克斯·普朗克分子植物生理研究所。
本研究属于基因组编辑技术领域，具体聚焦于CRISPR-Cas系统衍生的碱基编辑器开发。碱基编辑器是能够在不产生DNA双链断裂、无需供体模板的情况下实现单核苷酸替换的强大工具。传统的CBE和ABE仅能实现嘧啶-嘧啶或嘌呤-嘌呤的碱基转换，而C到G碱基编辑器能将C•G碱基对转换为G•C，实现碱基颠换，从而大大扩展了可纠正的致病突变类型和治疗应用范围。然而，现有的CG-BE存在两大主要局限：其一，编辑窗口狭窄且位置固定，主要作用于PAM远端第6位点；其二，编辑效率高度依赖底物序列上下文，尤其偏好AT富集区域，这严重限制了其应用靶点的选择。为解决这些瓶颈，本研究旨在通过系统性的脱氨酶工程，开发具有扩展靶点选择性、更高精度和更广泛序列兼容性的新型高精度C-to-G碱基编辑器。
本研究的工作流程复杂且系统，主要分为以下几个关键步骤和阶段：
第一阶段：新型脱氨酶筛选与初步特性鉴定 研究首先以二倍体酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743为模型系统，评估了多种不同脱氨酶与nCas9（D10A切口酶）融合构建的CBE、miniCGBE（不含UNG）和CGBE（含UNG）的编辑性能。测试的脱氨酶包括大鼠APOBEC1、其突变体RA1(R33A)、人源APOBEC3A及其工程化变体EA3A，以及来自海七鳃鳗的APOBEC同源物PMCda1（简称CDA1）。通过一个包含多个连续胞嘧啶（polyC）的严格测试靶点，评估各编辑器在不同位置的编辑效率（C-to-T, C-to-G, C-to-A）和编辑窗口。结果发现，基于APOBEC家族的编辑器主要编辑第5或第6位点，而基于CDA1的编辑器，无论其与nCas9融合的末端方向如何，均展现出独特的编辑窗口，其编辑偏好明显集中于PAM远端的第3位点。这一发现初步实现了研究目标之一——扩展CG-BE的编辑窗口。
第二阶段：CDA1工程化以提升C-to-G编辑效率与纯度 在第一阶段发现的基础上，研究团队假设通过缩小脱氨酶的编辑窗口可以提升C-to-G编辑的效率和精度。受此前研究发现CDA1 C端截短能显著缩窄其在CBE中的编辑窗口的启发，本研究构建了一系列C端截短（缺失13-20个氨基酸）的CDA1变体，并将其分别与nCas9融合，构建了14个CDA1Δ-CGBE和CDA1Δ-miniCGBE。在三个不同的polyC靶点上对这些工程化编辑器进行性能评估。数据分析通过高通量测序进行：提取酵母基因组DNA，PCR扩增目标区域并加索引标签，混合建库后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序。使用定制脚本将测序reads与参考序列比对，计算每个位点上目标碱基变化的百分比，从而得出编辑效率和产物纯度（即所有编辑等位基因中仅含有所需C-to-G编辑的比例）。
结果表明，与全长CDA1构建的CGBE相比，截短变体（尤其是CDA1Δ194）的C-to-G编辑效率得到了显著提升（提高9.5至24倍）。同时，含有UNG1（尿嘧啶-DNA糖基化酶）的CGBE相较于不含UNG的miniCGBE，能更有效地抑制非目标的C-to-T和C-to-A编辑副产物，从而将C-to-G的编辑纯度提高到约80%，同时保持了较低的indel频率（%）。这表明通过C端截短工程化CDA1是开发高精度、高效率CGBE的有效策略。
第三阶段：在复杂基因组序列中验证编辑精度与序列兼容性 为了验证工程化CGBE在更接近自然基因组环境下的性能，研究选取了酵母*CAN1*基因内的四个位点，这些位点在目标C3位点附近存在额外的胞嘧啶。对比全长和三个截短CDA1 CGBE及其对应CBE的编辑结果显示，截短CGBE展现出极高的编辑精度，主要编辑C3位点，其效率相比邻近C位点高出多达22倍。编辑产物分析表明，截短CGBE主要产生单一位点C3-to-G修饰的产物，占所有编辑产物的45%-63%。
接下来，为了评估新型编辑器对不同序列上下文的兼容性，研究团队测试了CDA1Δ194-CGBE、CDA1Δ188-CGBE以及两种C端融合编辑器在15个涵盖广泛序列背景的内源靶点上的C-to-G编辑效率，并与当前主流的RA1(R33A)-CGBE进行比较。高通量测序数据分析揭示，RA1(R33A)-CGBE平均编辑效率仅约2%，且在TC上下文之外效率极低。相比之下，CDA1基CGBE，特别是CDA1Δ194-CGBE，展现出优异的序列兼容性，在所有测试位点平均编辑效率达到22%，比RA1(R33A)-CGBE最高提升了11倍。进一步在21个覆盖所有NC N三核苷酸背景的靶点测试证实，CDA1Δ194-CGBE与大多数序列背景兼容，效率在10%至53.7%之间。研究还尝试融合BER蛋白XRCC1以进一步提升效率，但效果不显著；并比较了N端与C端融合截短CDA1的效果，发现N端融合截短变体（CDA1Δ194-CGBE）效率最优。
第四阶段：全基因组脱靶编辑分析 鉴于脱氨酶固有的DNA结合活性可能导致不依赖sgRNA的基因组范围脱靶编辑，本研究评估了全长及一系列C端/N端截短CDA1 CGBE的脱靶效应。通过将表达不同CGBE并靶向*CAN1*位点的酵母菌株经半乳糖诱导后，涂布在L-刀豆氨酸筛选平板上，挑选抗性克隆，混合培养后提取基因组DNA进行全基因组测序。生物信息学分析比较了不同编辑器处理组与对照组的单核苷酸变异和indel数量。结果表明，全长CDA1 CGBE诱导的SNV数量显著高于对照，而所有截短版本，特别是CDA1Δ161-CGBE和CDA1Δ28-161-CGBE，其诱导的SNV数量与对照组相当，表明截短有效降低了基因组范围的DNA脱靶编辑。此外，RNA-seq分析显示，CDA1Δ-CGBE诱导的RNA脱靶编辑水平与阴性对照组相当或低于EA3A-CGBE和RA1(R33A)-CGBE。
第五阶段：在高等真核细胞中验证通用性 为验证工程化策略在不同生物系统中的普适性，研究构建了适用于人类细胞（H-CDA1Δ194-CGBE）和水稻细胞（P-CDA1Δ194-CGBE）的编辑器。在人类HEK293T细胞中，通过质粒转染和流式分选mCherry阳性细胞进行编辑分析；在水稻中，通过农杆菌介导法转化宁粳7号胚性愈伤组织，筛选后提取DNA进行基因分型。分别在8个人类内源靶点和4个水稻内源靶点上进行测试。结果显示，在人类和水稻细胞中，CDA1Δ194-CGBE同样主要编辑C3位点，且编辑效率相比全长编辑器分别提高了1.24-15.01倍（人类，平均~16.4%）和27.11-215.07倍（水稻，平均~4.1%），证实了截短CDA1策略在酵母、动物和植物细胞中均有效。
本研究的主要结果相互关联，逻辑递进：1）发现了CDA1能提供独特的C3偏好编辑窗口，解决了现有CG-BE窗口固定的问题；2）通过C端截短工程化，大幅提升了C-to-G编辑的效率和纯度；3）证明了工程化CGBE在复杂基因组序列中具有高精度和广泛的序列兼容性，克服了序列依赖性的限制；4）证实截短设计能有效降低全基因组范围的DNA和RNA脱靶效应，提升了安全性；5）成功在人类和水稻细胞中验证了该策略的有效性，证明了其跨物种应用的潜力。这些结果共同支持了研究的核心结论：成功开发出了一套基于CDA1工程化的、具有高精度、扩展的位点选择性（C3窗口）和优异靶点兼容性的新型C-to-G碱基编辑器。
本研究的结论是，通过系统的脱氨酶探索和蛋白质工程，成功开发了基于CDA1的新型高精度C-to-G碱基编辑器。这些编辑器不仅将有效编辑窗口扩展至原先难以触及的PAM远端第3位点，还通过C端截短优化，实现了编辑效率和产物纯度的大幅提升，同时显著降低了脱靶风险。更重要的是，它们表现出对广泛底物序列上下文的良好兼容性，突破了现有工具对AT富集序列的严重依赖。该研究极大地丰富了碱基编辑工具箱，为在基因治疗中纠正更广泛的致病点突变、在农业中进行精准育种以及在基础研究中实现精确的基因型-表型关联研究提供了强大且更具通用性的新工具。
本研究的亮点在于：1）重要的科学发现：首次系统鉴定并报道了基于CDA1的CGBE具有独特的C3偏好编辑窗口，并证实通过缩小编辑窗口的蛋白质工程策略能有效优化C-to-G编辑性能。2）新颖的方法学：创造性地将此前在CBE中验证有效的CDA1截短策略应用于CGBE的工程化，并系统评估了不同截短长度对效率、精度和脱靶的影响，为同类工具开发提供了清晰的工程范式。3）突出的成果特性：最终获得的CDA1Δ-CGBE综合性能优异，集扩展的编辑范围、高效率、高精度、低脱靶和宽序列兼容性于一身，是现有C-to-G编辑工具的重要升级。4）严谨的验证体系：从酵母模型到人类、植物细胞，研究进行了多层次、跨物种的功能验证，充分证明了该技术平台的稳健性和通用性。
此外，研究还包含了一些有价值的对比分析，例如与近期报道的糖基化酶编辑器DAF-CBE和CE-CDG的比较，显示CDA1Δ194-CGBE在编辑C3位点时具有更高的平均效率；以及与不同Cas9变体或正交Cas蛋白结合可能性的讨论，为未来进一步扩展靶向范围指明了方向。这些内容共同构成了一项从基础发现到技术优化，再到多体系验证的完整且扎实的研究工作，对推动基因组编辑领域的发展具有重要价值。