一、 研究作者、机构及发表信息

本研究的主要作者为 Haiquan Yang, Xiao Lu, Jinyuan Hu, Yuan Chen, Wei Shen 以及 Long Liu。他们均来自江南大学，糖化学与生物技术教育部重点实验室。该研究成果以“Boosting secretion of extracellular protein by Escherichia coli via cell wall perturbation”为题，于2018年发表在《Applied and Environmental Microbiology》期刊的第84卷第20期，文章编号为 e01382-18。

二、 学术背景

本研究隶属于微生物工程与合成生物学领域，具体聚焦于重组蛋白表达技术。大肠杆菌（*Escherichia coli*）因其生长迅速、遗传操作简便、可实现高水平蛋白表达等优势，成为最广泛使用的重组蛋白表达宿主之一。然而，大肠杆菌的一个显著局限性在于其无法高效地将重组蛋白分泌到细胞外空间。细胞内积累的蛋白质易被蛋白酶降解，且后续纯化步骤复杂、成本高昂。此外，在某些代谢工程应用中，例如需要处理无法被细胞有效吸收的毒性底物时，将重组酶分泌到胞外环境变得尤为重要。

大肠杆菌的细胞表面结构，特别是由肽聚糖（Peptidoglycan）构成的细胞壁，是维持细胞结构完整性和稳定性的关键。肽聚糖网络为细胞提供了机械强度以抵抗渗透压。以往的研究表明，破坏细胞表面结构（例如通过化学、酶学或机械方法）可以促进周质空间蛋白的被动释放。一种极端的例子是细菌L-型（完全缺失细胞壁），曾被用于提高某些蛋白的分泌，但其存在蛋白表达水平低、生长缓慢、鲁棒性差等缺点，限制了工业应用。

在肽聚糖的生物合成与修饰网络中，青霉素结合蛋白（Penicillin-binding proteins, PBPs）扮演着核心角色。其中，低分子量PBPs（如PBP4, PBP5, PBP6, PBP6b，分别对应D,D-羧肽酶（D,D-carboxypeptidase）DacB, DacA, DacC, DacD）并非细胞生长所必需，但在肽聚糖交联、结构稳定和细胞壁修饰中起重要作用。DacA和DacB是两种关键的D,D-羧肽酶，它们能切割肽聚糖前体五肽侧链末端的D-丙氨酸，从而影响肽聚糖网络的成熟与结构。

基于上述背景，本研究提出了一个创新性的策略：通过扰动而非完全摧毁细胞壁肽聚糖网络，来增强大肠杆菌的胞外蛋白分泌能力。具体而言，研究旨在通过删除编码D,D-羧肽酶的基因*dacA*和*dacB*，破坏肽聚糖网络的正常结构，从而增加外膜通透性，最终提高重组蛋白向胞外环境的分泌效率。本研究的目标是系统评估*dacA*和*dacB*单敲除及双敲除对大肠杆菌BL21的细胞生长、形态、肽聚糖代谢、以及多种模型蛋白（不同分子量）胞外分泌的影响，并探究其潜在机制。

三、 详细研究流程

本研究是一个系统性的工程与表征工作，主要包含以下几个流程：

1. 基因敲除突变株的构建：

   • 研究对象与方法： 以大肠杆菌BL21(DE3)为亲本菌株。
   • 实验流程： 使用Red同源重组系统，分别构建了*dacA*单敲除突变株（BL21 Δ*dacA*）、*dacB*单敲除突变株（BL21 Δ*dacB*）以及dacA/*dacB*双敲除突变株（BL21 ΔdacA Δ*dacB*）。首先，通过PCR构建两端带有FRT位点和目标基因同源臂的敲除盒（δdacA::kan和δdacB::kan），其中卡那霉素抗性基因作为筛选标记。将这些敲除盒电转入含有表达Red重组酶辅助质粒pKD46的BL21细胞中，通过同源重组将目标基因替换。随后，通过高温培养消除温度敏感的pKD46质粒，并利用表达FLP重组酶的pCP20质粒切除染色体上的抗性基因，最终获得无抗性标记的纯净敲除株。所有突变株均通过PCR进行验证。

2. 重组表达质粒的构建：

   • 研究对象与方法： 选择四种不同分子量的蛋白质作为模型蛋白：绿色荧光蛋白（GFP， 26.8 kDa）、成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2， 28.2 kDa）、胶原蛋白E4（Collagen E4， 12.8 kDa）和淀粉酶AmyK（62.8 kDa）。
   • 实验流程： 通过PCR从合成质粒中扩增*gfp*和*amyK*基因，并分别克隆到表达载体pETDuet中，构建重组质粒pETDuet-gfp和pETDuet-amy。这些质粒不包含引导蛋白跨膜分泌的信号肽序列，旨在观察在细胞壁扰动下，原本胞内表达的蛋白能否被释放到胞外。将构建好的质粒分别转入野生型BL21及各敲除突变株中，获得一系列重组表达菌株。

3. 突变株的表型分析：

   • 细胞生长分析： 在LB和TB培养基中培养各菌株，监测其生长曲线，计算最大细胞干重（DCW）和特定生长速率，以评估基因敲除对细胞基本生理的影响。
   • 细胞内可溶性肽聚糖积累分析： 培养8小时后收集细胞，破碎后提取可溶性肽聚糖片段。通过测量片段中葡糖胺（Glucosamine）的浓度，来量化不同菌株细胞内可溶性肽聚糖前体/回收中间产物的积累情况。
   • 细胞形态分析：
     • 流式细胞术（FACS）： 使用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）分析细胞群体分布。FSC与细胞大小相关，SSC与细胞内部复杂度（如形状不规则性）相关。通过绘制FSC-SSC点图及FSC单参数分布图，定量比较突变株与对照菌在细胞形态上的整体差异。
     • 透射电子显微镜（TEM）： 对菌体进行直接观察，获得高分辨率的细胞形态图像，用于确认流式细胞术的结果并观察更细微的结构改变，如细胞壁透明度、膨出等。

4. 胞外蛋白分泌能力评估：

   • GFP、FGFR2、E4的分泌检测： 将携带pETDuet-gfp等质粒的菌株进行诱导表达。离心收集发酵上清液（胞外样品）和细胞裂解上清液（胞内样品）。
     • 对于GFP，使用荧光酶标仪直接测定胞外上清液中的荧光强度，并换算成比荧光强度（单位DCW的荧光单位）。同时进行SDS-PAGE电泳，直观比较胞外样品中GFP蛋白条带的强弱。
     • 对于FGFR2和E4，主要通过SDS-PAGE电泳分析胞外样品中相应蛋白条带的丰度。
   • 淀粉酶（AmyK）的分泌检测：
     • 酶活测定： 采用DNS法测定胞外和胞内样品的淀粉酶活性，计算胞外比酶活、总酶活以及胞外酶活占总酶活的百分比（分布率）。同时计算了胞外淀粉酶的比生产速率。
     • SDS-PAGE分析： 对胞外样品进行电泳，确认淀粉酶蛋白的分泌情况。
   • β-半乳糖苷酶（内源性胞内酶）的泄露检测： 测定各菌株（不携带重组质粒）胞外上清液中的β-半乳糖苷酶活性。该酶正常情况下完全存在于细胞内，其胞外活性的出现直接反映了细胞膜的完整性受损或通透性增加。

5. 外膜通透性测定：

   • 研究方法： 使用疏水性荧光探针N-苯基-1-萘胺（NPN）进行评估。NPN在亲水环境中荧光很弱，当外膜受损，疏水区域暴露时，NPN可插入其中并发出强荧光。
   • 实验流程： 将NPN与菌体悬浮液混合，立即用荧光酶标仪测定荧光强度。荧光强度的增加直接反映了细胞外膜通透性的增高。

6. 数据分析：

   • 所有实验均独立重复至少三次，数据以平均值±标准差表示。
   • 使用学生t检验进行统计分析，P值小于0.05被认为具有统计学显著性。在进行t检验前，先进行F检验以确定整体是否存在显著差异。

四、 主要研究结果

1. 基因敲除对细胞生长的影响： 删除*dacA*对BL21的生长没有显著抑制。然而，删除*dacB*显著降低了细胞的最高干重（从11.4 g/L降至6.9 g/L）和特定生长速率（从1.8 h⁻¹降至1.0 h⁻¹）。双敲除株的生长也受到抑制，但其生长速度略快于*dacB*单敲除株。这表明DacB比DacA对大肠杆菌BL21的生长更为关键，而双敲除可能在两种酶活性缺失之间达到了某种新的、对生长稍有利的平衡。

2. 基因敲除导致细胞内可溶性肽聚糖积累： 培养8小时后，野生型细胞的可溶性肽聚糖葡糖胺浓度为32.4 mg/g DCW。而*dacA*单敲除、*dacB*单敲除和双敲除突变株的浓度分别显著升高至132.8、46.7和54.2 mg/g DCW。尤其是*dacA*单敲除，积累最为显著。这一结果证实，删除*dacA*和*dacB*干扰了肽聚糖的正常代谢循环，导致其可溶性前体或回收产物在细胞内大量积累，暗示细胞壁的合成与重塑过程发生了紊乱。

3. 基因敲除改变细胞形态：

   • 流式细胞术： 突变株的细胞群体在FSC-SSC图上分布更为分散，FSC单参数分布图显示其细胞大小分布范围与对照菌明显不同。落在特定“门”内的细胞比例，突变株（55.0% - 65.1%）均高于对照菌（58.9%），表明细胞群体形态均一性下降，出现了更多形态异常的细胞。
   • 透射电镜： 图像提供了直观证据：*dacA*和*dacB*单敲除菌株的细胞形状比野生型更不规则，细胞宽度增加。*dacB*单敲除菌的细胞极部出现了局部透明的膨出。双敲除菌株则出现了更明显的透明球状肿胀。这些形态学变化直接证明了删除*dacA*和*dacB*破坏了大肠杆菌细胞壁肽聚糖网络的正常刚性结构。

4. 基因敲除显著增强胞外重组蛋白分泌：

   • GFP： 与对照菌相比，*dacA*单敲除、*dacB*单敲除和双敲除突变株的胞外GFP荧光强度分别提高了约2.0倍、2.2倍和2.7倍。SDS-PAGE显示突变株胞外样品中GFP条带明显更浓。
   • FGFR2和E4： SDS-PAGE分析同样表明，突变株分泌这两种蛋白的能力强于对照菌。
   • 淀粉酶AmyK： 这是分子量最大的模型蛋白（62.8 kDa）。诱导36小时后，*dacA*和*dacB*单敲除突变株的胞外淀粉酶比酶活分别是对照菌的2.5倍和3.1倍，分泌能力提升非常显著。其胞外酶活分布率也从对照的63.7%分别提高到78.5%和88.6%。双敲除株的胞外酶活和分布率也有所提高，但提升幅度小于单敲除株，且总酶活不高，表明双敲除可能不利于该大分子量淀粉酶的异源表达。SDS-PAGE结果与酶活数据一致。

5. 基因敲除增加内源性酶泄露： 胞外β-半乳糖苷酶活性在*dacA*单敲除、*dacB*单敲除和双敲除突变株中分别提高了2.0倍、2.2倍和3.1倍。这一结果至关重要，因为它证明细胞壁扰动导致的蛋白分泌增强并非仅针对重组蛋白，而是普遍增加了细胞内容物向外泄露的可能性，强烈提示细胞屏障功能受损。

6. 基因敲除增加外膜通透性： NPN荧光强度测定显示，与对照菌相比，所有突变株的结合NPN荧光强度均增加，其中双敲除株增加了1.3倍。这直接证实了删除*dacA*和*dacB*破坏肽聚糖网络后，导致了大肠杆菌外膜通透性增加。这一机制性结果将前面的表型（形态改变）与功能表型（蛋白分泌增强、酶泄露）联系了起来。

五、 研究结论与意义

本研究得出明确结论：通过删除大肠杆菌中的D,D-羧肽酶基因*dacA*和*dacB*来扰动细胞壁肽聚糖网络，是一种有效增强胞外蛋白分泌的新策略。这种扰动破坏了细胞壁的完整性，导致细胞形态异常、外膜通透性增加，从而促进了包括重组蛋白和内源性酶在内的多种蛋白质被动扩散到细胞外环境。

其科学价值在于： 1. 深化了对细胞壁合成酶功能的理解： 系统比较了*dacA*和*dacB*在维持细胞生长、形态及屏障功能中的不同作用，揭示了它们在肽聚糖代谢网络中的独特角色。 2. 提出了蛋白质分泌的新机制路径： 将细胞壁结构完整性的“主动维持”与蛋白质的“被动外排”联系起来，为理解革兰氏阴性菌的胞外物质运输提供了新视角。 3. 开发了一种新的代谢工程工具： 与完全去除细胞壁的L-型细菌相比，这种可控的、部分的细胞壁扰动策略在提高分泌能力的同时，更好地保留了宿主菌的生长和表达特性，更具应用潜力。

其应用价值在于： 1. 提升大肠杆菌作为细胞工厂的性能： 该方法可以简化下游纯化工艺，降低生产成本，并可能应用于需要胞外酶催化的生物转化过程。 2. 具有普适性和可调性： 策略对多种不同分子量的蛋白质均有效，且通过选择单敲除（*dacA*或*dacB*）或双敲除，可以根据目标蛋白的特性进行优化。 3. 为其他微生物的分泌工程提供借鉴： 类似的基于细胞壁合成途径的基因工程策略，可能适用于其他重要的工业微生物。

六、 研究亮点

1. 创新性的策略： 首次系统地利用删除非必需肽聚糖修饰酶（D,D-羧肽酶）基因来扰动细胞壁，从而提高蛋白分泌，策略新颖且具有清晰的生物学逻辑。
2. 系统全面的表征： 研究不仅关注最终的分泌效率，还深入表征了基因敲除对细胞生长、肽聚糖代谢、细胞超微结构、外膜通透性等多层次的影响，构成了完整的证据链，使结论非常坚实。
3. 多重模型验证： 使用了从12.8 kDa到62.8 kDa不同分子量的多种蛋白质进行验证，证明了该策略的广泛适用性，并发现了其对大分子量蛋白分泌的特别显著效果。
4. 机制阐释清晰： 通过β-半乳糖苷酶泄露实验和外膜通透性实验，将表型与“细胞屏障功能减弱”这一核心机制直接挂钩，完成了从基因操作到表型输出再到机制阐释的闭环。
5. 兼顾基础与应用： 工作既有对基础生物学问题（细胞壁酶功能、形态维持）的探索，又明确指向了工业生物技术的应用目标，是一项优秀的转化型研究。

七、 其他有价值的内容

研究中还观察到一些有价值的细节，例如：*dacA*单敲除对可溶性肽聚糖积累的影响最大，但对生长的抑制最小；*dacB*单敲除对生长抑制最强，但对淀粉酶分泌的提升效果最好；双敲除在提升某些蛋白（如GFP、β-半乳糖苷酶）分泌上效果最佳，但对淀粉酶的总产量可能有负面影响。这些细微的差异提示，DacA和DacB在细胞壁网络中可能具有部分冗余但又各自独特的功能，在实际应用中需要根据目标产物的特性（如分子量、表达时期）对工程策略进行精细化选择和优化。此外，补充材料中详细的基因敲除方法和菌株构建流程，也为其他研究者重复或拓展此项工作提供了便利。