这项研究由日本京都大学（Kyoto University）和东京农工大学（Tokyo University of Agriculture and Technology）的Yoshiaki Kamiyama、Taishi Umezawa等团队合作完成，于2024年12月19日发表在《PNAS》（Proceedings of the National Academy of Sciences）期刊上，标题为《Hyperosmolarity-induced suppression of group B1 RAF-like protein kinases modulates drought-growth trade-off in Arabidopsis》。研究聚焦植物应对渗透胁迫（如干旱或高盐）时生长与胁迫响应的平衡机制，揭示了B1亚组RAF-like蛋白激酶（B1-RAFs）通过磷酸化调控介导这一生理权衡的分子框架。

学术背景

植物在干旱等渗透胁迫下需重新分配能量以维持生存，表现为生长抑制和胁迫响应增强的“权衡”（trade-off）。此前研究发现，B2/B3/B4亚组RAF-like激酶通过激活SNRK2（蔗糖非发酵相关蛋白激酶2）正调控胁迫响应，但B1-RAFs（含RAF13、RAF14、RAF15）的功能未知。本研究旨在解析B1-RAFs如何通过磷酸化动态调控植物生长与胁迫响应的平衡。

研究流程与实验设计

1. 磷酸化蛋白质组学筛选

   • 对象：拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col-0）幼苗，干旱处理0/3/5/9天。
     
   • 方法：无标记定量磷酸化蛋白质组学分析，鉴定胁迫响应磷酸化位点。
     
   • 关键发现：B1-RAF成员RAF13的多个丝氨酸位点（如S310/S313）在干旱下显著去磷酸化，而B3/B4-RAFs和SNRK2则被激活（图1B）。免疫印迹（Western blot）证实RAF13蛋白电泳迁移率在渗透胁迫（400 mM NaCl或800 mM山梨醇）30分钟后降低，提示其去磷酸化（图1C）。
     

2. RAF13功能验证

   • 遗传材料：构建RAF13/14/15单突变、双突变（raf13-1raf15-1）及三突变（b1-tko）株系，以及RAF13磷酸化模拟（7D）和非磷酸化（7A）转基因株系。
     
   • 表型分析：
     
     • 生长表型：b1-tko在正常条件下根长显著缩短，但对渗透胁迫敏感性无差异（图2A-B）。
       
     • ABA响应：b1-tko对ABA超敏感（子叶绿化率降低60%），而RAF13过表达株系表现ABA不敏感（图2D-E）。
       
     • 蛋白稳定性：渗透胁迫下RAF13蛋白降解加速，磷酸化模拟突变体（7D）可缓解此现象（图1H-I）。
       

3. 激酶活性与互作网络解析

   • 体外激酶实验：重组RAF13能自磷酸化并磷酸化组蛋白，但其活性在渗透胁迫后降低（图1F-G）。
     
   • 互作蛋白鉴定：
     
     • IP-MS：发现RAF13与AGC激酶IREH1及PP2A-B55（蛋白磷酸酶2A的B55调节亚基）形成复合物（图4A）。
       
     • 验证实验：酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）证实RAF13/15与IREH1直接互作（图5A-B）。
       
     • 磷酸酶调控：抑制剂Cantharidin（CT）或敲低PP2A-B55可阻断RAF13去磷酸化，表明PP2A-B55直接去磷酸化RAF13（图4C-F）。
       

4. 信号通路独立性验证

   • SNRK2调控排除：RAF13不能磷酸化SNRK2（如SRK2E），且b1-tko中SNRK2活性不受影响（图3A-D），表明B1-RAFs独立于已知的SNRK2通路。
     

主要结果与逻辑链条

1. RAF13去磷酸化驱动生长抑制：渗透胁迫下，PP2A-B55介导RAF13去磷酸化，导致其激酶活性丧失和蛋白降解，解除对生长的促进作用（图1, 4）。
   
2. B1-RAFs-IREH1复合物功能：RAF13/15与IREH1协同正调控生长，并负调控ABA响应。磷酸化蛋白质组显示，raf13-1raf15-1与ireh1-2突变体中83.1%的磷酸化肽段下调，富集于细胞分裂相关通路（图5E-F）。
   
3. 生理权衡模型：正常条件下，RAF13-IREH1促进生长；渗透胁迫时，PP2A-B55抑制该复合物，优先激活胁迫响应（图5G）。
   

结论与价值

1. 科学价值：首次揭示B1-RAFs通过“激酶-磷酸酶”动态调控植物生长-胁迫权衡，补充了RAF家族功能的多样性。
   
2. 应用潜力：为作物抗旱遗传改良提供新靶点，如调控RAF13磷酸化状态以平衡生长与抗逆性。
   

研究亮点

1. 创新发现：提出PP2A-B55/RAF13-IREH1模块作为SNRK2之外的独立调控通路。
   
2. 技术方法：整合磷酸化蛋白质组学、遗传学与生化互作分析，系统性解析蛋白磷酸化网络。
   
3. 生理意义：阐明植物渐进式干旱适应的分子机制，即B1-RAFs在早期胁迫响应中的“刹车”作用。
   

其他价值

研究还发现PP2A-B55通过RAF13调控气孔开度（图2F），暗示其在水分利用效率中的潜在作用。数据已公开于日本蛋白质组数据库（JPOST），为后续研究提供资源。