类型a：学术研究报告

作者及机构
本研究由Lei Liu、Liang Si、Lishuang Zhang、Rui Guo、Ruixin Wang、Haimei Dong和Changhong Guo*共同完成，通讯作者为Changhong Guo（邮箱：kaku3008@hrbnu.edu.cn）。研究团队来自哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江省分子细胞遗传学与遗传育种重点实验室。论文于2024年6月29日在线发表于期刊 *The Plant Journal*（2024年第119卷，1900-1919页），标题为《代谢组学与转录组学分析揭示紫花苜蓿对冷与盐碱复合胁迫的响应机制》（”Metabolomics and transcriptomics analysis revealed the response mechanism of alfalfa to combined cold and saline-alkali stress”）。

学术背景
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是全球最重要的牧草之一，但其在高纬度盐碱土壤中常同时面临冷胁迫与盐碱胁迫的复合压力。尽管植物对单一胁迫的响应机制已有较多研究，但复合胁迫的协同作用机制尚不明确。此前研究表明，植物对单一胁迫的耐受性未必能推广至复合胁迫（如冷与盐碱），而复合胁迫可能通过独特的分子与代谢途径影响植物生理。因此，本研究旨在通过多组学技术解析紫花苜蓿对冷与盐碱复合胁迫的响应机制，重点关注类黄酮代谢途径的关键调控基因及其功能。

研究流程
1. 实验材料与胁迫处理
- 选取耐逆品种“肇东”（Zhaodong, ZD）和敏感品种“蓝月”（Blue Moon, BM），在温室中培育50天后，转移至人工气候室进行复合胁迫处理（0°C冷胁迫+200 mM Na+盐碱溶液，每2天浇灌一次）。
- 胁迫5天后采集叶片样本，分为三部分：生理指标测定、代谢组学分析和转录组测序。

1. 表型与生理分析

   • 测定株高、根长、鲜重、干重等形态指标，以及丙二醛（MDA）、游离脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、超氧化物歧化酶（SOD）等生理指标。
     
   • 通过叶绿素荧光成像系统（FluorCam）分析光合参数（如PSII最大光化学效率Fv/Fm）和电子传递速率（ETR）。
     
   • 透射电镜观察叶绿体超微结构变化。
     

2. 代谢组学分析

   • 采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢组检测，筛选差异代谢物（DEMs，VIP≥1且p≤0.05）。
     
   • 通过KEGG富集分析确定关键代谢通路（如类黄酮合成、α-亚麻酸代谢）。
     

3. 转录组测序与数据分析

   • 使用Illumina NovaSeq 6000平台进行RNA-seq，每个样本获得4900万~6510万条高质量reads（Q30>92.51%）。
     
   • 差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log2FC|>1且FDR<0.05，通过WGCNA构建共表达网络，筛选核心模块（如与类黄酮含量显著相关的mm.brown模块）。
     

4. 关键基因功能验证

   • 通过qRT-PCR验证类黄酮合成途径基因（如*MsFLS13*、*MsCHS*）和转录因子（如*MsMYB12*）的表达模式。
     
   • 利用过表达*MsFLS13*的转基因紫花苜蓿株系（OE10/OE13/OE16）进行抗逆性表型分析，测定类黄酮含量与抗氧化酶活性。
     

主要结果
1. 生理与表型差异
- ZD在复合胁迫下表现出更强的耐受性：其株高、生物量显著高于BM（p<0.01），且MDA和H2O2积累量更低（图1）。
- ZD的叶绿体结构完整，而BM的类囊体严重解体（图3），光合效率（Fv/Fm）下降更显著（图2）。

1. 代谢组学特征

   • ZD特异性积累蔗糖、海藻糖（VIP=15.13）和类黄酮（如紫铆花素，log2FC=1.72），而BM的茉莉酸（JA）和α-亚麻酸含量显著降低（表1）。
     
   • 类黄酮合成途径的中间产物（如二氢山奈酚）在ZD中富集，与转录组数据中*MsFLS13*的上调一致（图5）。
     

2. 转录调控网络

   • WGCNA分析发现，*MsMYB12*是mm.brown模块的核心基因，与*MsFLS13*、*MsCHS5*等类黄酮合成基因高度共表达（图6f）。
     
   • 转基因实验证实，过表达*MsFLS13*可提高类黄酮含量（增加37%）、降低ROS水平，并增强复合胁迫耐受性（图8）。
     

结论与意义
本研究首次阐明了紫花苜蓿通过类黄酮代谢途径响应冷与盐碱复合胁迫的分子机制：
1. 科学价值：揭示了*MsMYB12-MsFLS13*调控轴的核心作用，为植物复合胁迫响应理论提供了新视角。
2. 应用价值：为培育耐逆牧草品种提供了分子靶点（如*MsFLS13*基因编辑），并提出了利用盐碱地种植紫花苜蓿的可行性策略。

研究亮点
1. 多组学整合分析揭示了代谢物（如海藻糖、JA）与基因（如*MsMYB12*）的协同响应网络。
2. 发现*MsFLS13*过表达可直接提升抗氧化能力，为分子设计育种提供了新工具。
3. 首次将叶绿体超微结构与光合参数变化关联，明确了复合胁迫对光系统的损伤机制。

其他价值
研究建立的WGCNA共表达网络可推广至其他豆科作物，而盐碱胁迫下的糖代谢数据为植物渗透调节研究提供了新参考。