本研究由北京化工大学生命科学与技术学院的Kun Yan、Jun Li、Wenya Wang以及清华大学化学工程系的Qiang Li合作完成，成果发表于2021年的《Applied Biochemistry and Biotechnology》期刊（卷193，页码4214–4227）。论文标题为《通过HIV-1病毒孔蛋白Vpu增强核膜通透性构建酿酒酵母中稳定的T7表达系统》。
学术背景
T7表达系统（T7 RNA polymerase/T7 promoter）源于T7噬菌体，是合成生物学、代谢工程和生物医学等领域的关键工具。该系统在原核生物（如大肠杆菌）中已成熟应用，但在真核生物中因缺乏转录后加工机制（如5’端帽结构和3’端多聚腺苷酸尾），导致T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）转录的mRNA无法有效穿越核膜进入细胞质，仅能实现瞬时表达。酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）作为重要工业微生物，此前尚未成功构建稳定T7表达系统。本研究提出利用病毒孔蛋白（viroporin） HIV-1 Vpu增强核膜通透性，以解决mRNA转运难题，目标是建立真核生物中可持续的T7蛋白表达平台。
研究流程与方法
1. 系统设计与菌株构建
- 宿主选择：以酿酒酵母BY4741为宿主，基因组整合核定位信号（NLS）-T7 RNAP表达单元（由半乳糖启动子pGAL驱动），确保T7 RNAP定位于细胞核内。
- 报告基因载体：构建两类质粒：
- 质粒1（pESC-ura-pt7-ires-hph-tcyc1-tt7）：含T7启动子驱动的潮霉素抗性基因（hph）及内部核糖体进入位点（IRES），用于验证基础表达。
- 质粒2（pESC-ura-nls-vpu-pt7-ires-hph-tcyc1-tt7）：额外引入NLS-Vpu融合蛋白基因，形成病毒孔蛋白依赖的T7表达系统（VD T7系统）。
- 实验菌株：通过电转化获得六组重组菌株，包括对照组（无hph）、yhph（仅hph）和yvpu-hph（含Vpu-hph），用于后续功能验证。
2. 核膜通透性验证
- 潮霉素抗性实验：
- 生长曲线：在含400 μg/mL潮霉素的培养基中，yvpu-hph的生长速率显著高于yhph，而对照组几乎不生长（图2a）。
- 点板实验：yvpu-hph在150–200 μg/mL潮霉素平板上形成更多菌落（图2b），表明Vpu显著提升hph蛋白产量。
- Vpu定位分析：通过共表达NLS-Vpu-EGFP（增强型绿色荧光蛋白）和DAPI核染色，共聚焦显微镜证实Vpu定位于核膜（图3），支持其通过改变核膜通透性促进mRNA转运的假设。
3. 荧光素酶表达验证
- NanoLuc®（NLuc）报告系统：构建ynluc（无Vpu）和yvpu-nluc（含Vpu）菌株，检测荧光素酶活性。结果显示，yvpu-nluc的发光强度是ynluc的2倍以上（p<0.05，图4），且菌体生长未受显著影响（图5），证明Vpu在提升外源蛋白表达量的同时不影响细胞生理状态。
主要结果与逻辑关联
- 潮霉素抗性实验初步揭示T7转录的hph mRNA可通过渗透扩散进入细胞质，但效率较低；引入Vpu后，蛋白表达量显著提升，验证了核膜通透性增强假说。
- Vpu定位实验为机制解释提供直接证据：NLS成功引导Vpu定位至核膜，其孔道功能可能通过物理破坏核膜屏障或调节转运通道实现。
- NLuc定量数据进一步扩展应用范围，证明该系统适用于非抗性蛋白的高效表达，且无细胞毒性，为工业化应用奠定基础。
结论与价值
本研究首次在酿酒酵母中构建了基于病毒孔蛋白的稳定T7表达系统，其科学价值体现在：
1. 机制创新：提出并验证了通过病毒孔蛋白增强核膜通透性的策略，突破了真核生物中T7 mRNA转运的瓶颈。
2. 技术通用性：VD T7系统可适配多种报告基因（如hph、nluc），为真核宿主复杂蛋白生产提供新工具。
3. 应用潜力：该系统无需依赖病毒载体或寄生生物特有的mRNA剪接机制，安全性高，适用于工业酶、疫苗抗原等大规模生产。
研究亮点
- 跨学科方法：融合合成生物学（T7系统改造）与病毒学（viroporin功能）解决真核表达难题。
- 创新性设计：首次将HIV-1 Vpu应用于核膜工程，其定位与功能验证为后续类似研究提供范式。
- 严谨验证体系：通过抗性表型、荧光定位和酶活定量多维度验证，数据支撑充分。
其他价值
论文补充材料详细列出了质粒图谱、引物序列和构建流程（图S1–S6，表S1–S2），为方法复现提供便利。此外，作者指出该系统在酵母中保持正常生理代谢的特性（图5），为其长期稳定性应用提供保障。