本研究由河南农业大学生命科学学院植物学系的Yong Li、Fu-De Shang等学者领衔，联合内蒙古师范大学、美国东卡罗莱纳大学、中国农业大学等多家科研机构合作完成，于2024年5月16日以《multiomics analyses provide insights into the genomic basis of differentiation among four sweet osmanthus groups》为题发表于《Plant Physiology》期刊（2024年195卷2815-2828页）。

学术背景

木犀科植物桂花（Osmanthus fragrans）是中国传统名花，根据花色和花期分为四大品种群：花色白至淡黄的Albus群、黄色的Luteus群、橙红色的Aurantiacus群以及全年开花的Asiaticus群。尽管已有两个桂花基因组发布（Yang等2018a；Chen等2021），但Albus和Aurantiacus群的代表性基因组仍属空白。本研究旨在通过多组学分析：①解析四个桂花品种群的系统发育关系；②揭示Aurantiacus群花色分化的遗传机制；③探究Asiaticus群多季节开花的分子基础；④鉴定芳香物质合成途径的关键基因。

研究流程与实验设计

1. 基因组测序与组装

对Aurantiacus群代表品种”状元红”（Zhuangyuanhong, ZYH）和Albus群”玉帘银丝”（Yulianyinsi, YLY）进行PacBio Sequel II平台测序，结合Hi-C技术构建染色体级别基因组。ZYH和YLY基因组大小分别为732.21 Mb和728.92 Mb，Contig N50达21.38 Mb和19.15 Mb，通过BUSCO评估完整度分别为98.5%和98.4%。使用MECAT进行初步组装，Pilon基于BGI短读长数据校正，最终通过Hi-C将92.20%（YLY）和93.53%（ZYH）序列锚定到23条假染色体。

2. 比较基因组学分析

整合已发表的Asiaticus群”日香桂”（Rixianggui, RXG）和Luteus群”柳叶金桂”（Liuyejingui, LYJG）基因组数据，通过OrthoFinder鉴定90个单拷贝基因构建系统发育树。使用MCMCTree估算分化时间，CAFE分析基因家族扩张/收缩。通过Syri检测结构变异（SVs），包括倒位（inversion）、易位（translocation）和拷贝数变异（CNV）。

3. 全长转录组分析

采用Oxford Nanopore技术对四个品种三个花期阶段（S1蕾期、S2香眼期、S3初花期）的花瓣进行转录组测序，每个阶段设3个生物学重复。通过Pychopper识别全长转录本，StringTie比对参考基因组，SUPPA2分析可变剪接（alternative splicing）事件，TAPAS检测可变多聚腺苷酸化（APA）位点。

4. 代谢组学分析

利用LC-MS检测72个花瓣样本（4品种×3阶段×6重复）的代谢物。正离子模式下检测到4,759种代谢物，负离子模式3,877种。通过Pearson相关性分析（|r|>0.5, p<0.05）筛选与芳香物质中间产物相关的基因。

5. 功能验证实验

针对类胡萝卜素裂解双加氧酶基因OfCCD4启动子的4-bp缺失（”TTGG”），设计分段启动子（P0全长、P1上游片段、P2下游片段）驱动GUS报告基因转化烟草叶片，通过组织化学染色和RT-qPCR验证表达差异。

主要研究结果

1. 系统发育关系：基于单拷贝基因的进化树显示，Asiaticus群最早分化（约1593万年前），其次为Aurantiacus群（约557万年前），Luteus与Albus群最后形成姐妹群（图2A）。Asiaticus群特有基因最多（256个），富集于19条生物系统通路；Aurantiacus群特有基因（229个）主要参与代谢途径。

2. 花色分化机制：

   • 比较基因组发现Aurantiacus群OfCCD4基因启动子区存在4-bp特异性缺失（位于CAAT-box上游1154 bp处），而其他三品种保留该序列（图4C）。
     
   • 启动子活性实验证实，含4-bp缺失的P2片段使GUS表达量显著降低（图5D），而160-bp大片段缺失（P1）无显著影响。
     
   • 该缺失导致OfCCD4在Aurantiacus群表达量仅为其他品种的1/3（图4D），减少β-胡萝卜素降解，累积橙红色色素。

3. 花期调控基因：

   • 鉴定44个开花网络基因在Asiaticus群存在显著结构变异，包括13个AP2基因对和3个SPL3基因对的域差异（补充图S7）。
     
   • AGE途径（自主开花途径）基因变异最显著，可能解释其多季节开花特性。

4. 芳香物质合成：

   • 通过代谢-基因表达关联分析，发现8个关键基因：
     
     • 芳樟醇途径：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS, RNA-OFR39942.1）与IPP中间产物强相关（r=0.82）
       
     • 紫罗兰酮途径：八氢番茄红素合成酶（PSY, RNA-OFR16706.1）与ζ-胡萝卜素含量显著相关（r=0.76）

结论与价值

本研究首次完成四大桂花品种群的基因组全景比对，揭示：
1. 理论价值：
- 确立Asiaticus→Aurantiacus→(Luteus+Albus)的系统发育框架
- 阐明启动子微缺失（4-bp）通过影响CAAT-box结合效率调控花色的新机制
- 为木犀科植物适应性进化提供基因家族扩张/收缩证据

1. 应用价值：
   
   • 开发可用于桂花分子育花的OfCCD4启动子标记
     
   • 44个开花网络基因为培育周年开花品种提供靶点
     
   • 芳香合成途径基因助力香气品质改良
     

研究亮点

1. 技术创新：结合ONT全长转录组与LC-MS代谢组，建立”中间产物-基因表达”关联分析新策略
   
2. 发现新颖性：首次报道CAAT-box邻近序列微缺失对木本观赏植物花色的调控作用
   
3. 资源系统性：发布目前最完整的桂花基因组资源库，涵盖所有主要品种群
   

其他重要发现

• 检测到15.3 MYA的木犀科全基因组复制事件（补充图S3）
  
• 发现Aurantiacus群特有的229个基因中，12个与类胡萝卜素代谢相关
  
• “玉帘银丝”中萜烯合成酶基因TPS（RNA-OFR12778.1）表达量显著高于其他品种，可能解释其特殊香气特征