本文属于类型a，即单一原创研究的学术论文。以下是对该研究的详细学术报告。
本研究由西湖大学生命科学学院的Dang Bobo、加州大学旧金山分校药物化学系的William F. DeGrado等人共同完成，论文发表于*Nature Methods*期刊，2019年4月，第16卷第4期，页码319–322，DOI为10.1038/s41592-019-0357-3。通讯作者为Bobo Dang和William F. DeGrado。
该研究属于化学生物学与蛋白质工程交叉领域。重组蛋白表达与纯化过程中，通常需要在目标蛋白的N端或C端融合不同标签以提高表达量、溶解性、折叠或纯化效率。然而，目标蛋白纯化后，往往需要去除这些融合标签。目前唯一能在生物相容条件下实现标签去除的策略是酶切，使用的蛋白酶包括烟草蚀纹病毒蛋白酶和凝血酶蛋白酶。但酶切方法存在若干缺陷：酶本身需要额外去除，增加纯化步骤；大规模生产时酶的成本高昂；酶切经常失败，尤其是膜蛋白的酶切位点靠近疏水结构域时；常用于溶解膜蛋白或包涵体蛋白的去垢剂和变性剂会使蛋白酶失活。化学切割方法如溴化氰虽然被使用过，但反应条件苛刻且序列特异性低。金属离子如钯离子、铜离子、镍离子也曾被探索用于化学切割，其中镍离子显示出较大潜力，但此前报道的最佳序列需要在50°C下加热约20小时，对大多数蛋白而言过于苛刻。基于此，本研究的目的是开发一种在生物相容条件下能够实现序列特异性化学切割蛋白质的新方法，以替代或补充酶切方法。
为了实现这一目标，研究团队采用了底物噬菌体展示技术。他们构建了一个六肽底物噬菌体文库，该文库位于N端AviTag和M13噬菌体pIII蛋白之间。在存在不同金属离子的条件下进行了四轮筛选，逐步提高筛选的严格性，包括缩短孵育时间和降低温度。对最终输出的噬菌体文库进行测序，识别出了使用镍离子进行切割的一致序列模式。该模式与先前报道一致，即丝氨酸和组氨酸在P1’和P3’位置非常有效，同时发现了P2’位置对组氨酸和P4’位置对苏氨酸的偏好。随后，他们选取了两个最富集的序列合成相应肽段，通过高效液相色谱测试切割效率。最频繁出现的序列–GSHHTDLP–在室温、pH 8.2条件下18小时内可达到90%的切割效率。研究发现P1位置的甘氨酸对高切割效率至关重要。将甘氨酸替换为丙氨酸会导致切割速率显著下降。机制上，这涉及镍离子辅助的P1羰基向P1’丝氨酸侧链的N-to-O酰基转移，生成的酯中间体随后在限速的酯水解步骤中被切割，因此对甘氨酸以外的残基的立体效应非常敏感。基于此，研究者在先前报道的切割序列中引入甘氨酸，得到了–GSRHW–序列，其切割效率略优于噬菌体筛选出的最佳序列。进一步确认–GSHHW–在短肽构建体中表现优于–GSRHW–。在微型蛋白SPI-2上测试显示，带有甘氨酸插入的序列在22°C、16小时内切割产率超过90%，而无甘氨酸插入则只有15%的产率。由此确定了最小序列–GSHHW–作为SNAC-tag。同时，研究发现CHES和HEPES缓冲液表现最佳，弱亲核试剂丙酮肟可略微加速切割且不引起非特异性切割。
在验证了SNAC-tag在肽段和小蛋白上的活性后，研究者进一步考察了其在酶切效率极低的困难案例中作为可切割标签的实用性。首先，将SNAC-tag与His标签融合到水溶性α螺旋束蛋白HB2225的N端。在His标签和HB2225之间，分别包含TEV切割位点或SNAC-tag。结果显示，TEV蛋白酶在标准条件下切割大多不完全，而含有SNAC-tag的构建体切割产率达到约80%。其次，在膜蛋白切割方面，研究者构建了设计膜蛋白3HBTMV2与T4溶菌酶通过TEV可切割连接子融合的蛋白。筛选多种构建体后，TEV切割水平非常低（<20%），而将TEV底物序列替换为SNAC-tag后，切割效率超过90%。这证明SNAC-tag完全兼容膜蛋白和去垢剂胶束环境。此外，在另外两个水溶性蛋白和一个膜蛋白中也实现了超过80%的切割完成度。
研究者还系统考察了缓冲液和去垢剂条件对SNAC-tag切割的影响。切割与常见温和去垢剂完全兼容，但部分被SDS抑制。强变性条件如6 M盐酸胍或8 M尿素也兼容，但效率降低，而浓度不超过2 M时无明显影响。SNAC-tag在pH 8.6时切割效率最高，pH 8.2和9.0时产率略有下降。去除盐对T4L-3HBTMV2切割影响很小，对HisTag-HB2225切割影响适中。HEPES和CHES缓冲液表现相当，Tris缓冲液会减慢切割速率。1 mM镍离子浓度似乎是高效切割所必需的。低浓度还原剂兼容。对于需要低温处理的蛋白，切割可在4°C下进行，但速率显著慢于室温。研究者还研究了从结合在镍NTA树脂上的蛋白上切割SNAC-tag的可行性。将1 mg HisTag-T4L-GSHHW-3HBTMV2装载到0.5 ml镍NTA树脂上，交换至切割缓冲液后加入1 mM氯化镍，22°C孵育过夜，树脂上切割几乎完成，与溶液中效率相当，且无含His标签的蛋白从珠子上洗脱。然而，当蛋白装载量大幅增加至每毫升树脂床体积50 mg蛋白时，切割过程中出现可见的蛋白沉淀，提示装载量是树脂上应用的重要变量。
为了进一步探索切割位点周围残基对切割效率的影响，研究者构建了第二个靶向噬菌体文库（–X1X2X3GSX4HX5X6X7–）。经过四轮筛选和测序，根据输出文库中序列的富集程度进行排序，选取了11个不同序列以及初始筛选的前两个序列，替换HisTag-HB2225和HisTag-T4L-3HBTMV2中的TEV底物位点进行镍离子切割。结果显示，多个SNAC-tag变体在标准条件下达到超过80%的切割效率。对于水溶性HisTag-HB2225，效率略低。这表明多种不同序列组合都可以实现高切割效率。要获得高切割效率，P1位置的甘氨酸、P1’的丝氨酸和P3’的组氨酸似乎是必需的，而P2’位置的疏水残基不受青睐。此外，还通过筛选数百个五邻近位置的肽段系统评估了周围残基的影响，鉴定出比–GSHHW–切割更好的肽段，但这些肽段在蛋白中表现并未更好。
本研究的核心结论是：SNAC-tag作为一种新的化学蛋白质切割策略，可插入水溶性和膜蛋白中，在生物相容条件下以与酶相当的效率实现序列特异性切割。该方法尤其有吸引力的是，当用作C端标签时，仅在释放蛋白的C端留下一个小甘氨酸残基。此外，该方法避免了后续去除酶的需求。关键的是，研究展示了在酶切失败的情况下SNAC-tag仍能成功的案例。研究者建议使用–GSHHW–作为通用SNAC-tag，尽管–GSRHW–也能高效切割。推荐切割条件为：蛋白浓度约1 mg/ml，1 mM氯化镍，0.1 M CHES缓冲液，0.1 M丙酮肟，pH 8.6，室温孵育，0.1–0.5 M氯化钠。预期SNAC-tag将大幅降低实验室和工业规模重组蛋白生产的成本和劳动，并在医学、基础生物学研究和生物技术领域得到广泛应用。
本研究的亮点在于：首先，SNAC-tag实现了生物相容条件下的序列特异性化学蛋白质切割，效率与酶相当，且在酶切失败的案例中表现出明显优势，尤其是膜蛋白切割。其次，该方法利用了噬菌体展示技术进行底物序列的发现和优化，并结合合成肽段和蛋白质进行验证，形成了一个完整的从发现到应用的流程。此外，研究详细考察了多种缓冲液、去垢剂、变性剂、还原剂、pH、温度、盐浓度和树脂上切割等条件的影响，为实际应用提供了全面的参数指导。最后，SNAC-tag切割后仅在目标蛋白C端留下一个甘氨酸残基，对蛋白结构和功能的影响极小，这是其相对于酶切和传统化学切割的另一大优势。