学术研究报告：利用碱基编辑技术开发小麦除草剂耐受性状及新型选择标记系统

一、研究团队与发表信息
本研究由中国科学院遗传与发育生物学研究所的Rui Zhang、Jinxing Liu（共同第一作者）及Caixia Gao、Linjian Jiang、Jiayang Li（共同通讯作者）领衔，联合中国农业大学植物保护学院的研究团队合作完成，成果于2019年5月发表于Nature Plants（卷5，页480-485）。

二、学术背景与研究目标
杂草是威胁全球粮食生产的主要因素之一，而除草剂耐受作物（herbicide-tolerant crops）是农民管理杂草的经济有效工具。然而，现有技术存在局限性：
1. 问题背景：
- 传统育种开发的咪唑啉酮类（imidazolinone, IMI）除草剂耐受小麦因残留问题（土壤中持久性长达数月甚至数年）无法在多熟制农业区（如中国）推广。
- 目前中国唯一注册的磺酰脲类（sulfonylurea, SU）除草剂甲基二磺隆（mesosulfuron）虽能控制小麦田杂草（如节节麦，*Aegilops tauschii*），但易对小麦造成药害。
2. 科学目标：
- 通过碱基编辑技术（base editing）在小麦中引入非转基因的除草剂耐受突变，开发对SU、IMI及芳氧苯氧丙酸酯类（aryloxyphenoxy propionate, APP）除草剂的多重耐受性状。
- 建立基于TaALS-P174位点编辑的选择性共编辑系统（selectable co-editing system），提高目标基因编辑效率。

三、研究流程与方法
1. 靶标基因选择与编辑策略：
- 靶基因：选择乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase, *ALS*）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coenzyme A carboxylase, *ACCase*）基因，因其已知点突变可赋予除草剂耐受性且对植物生长影响小。
- 碱基编辑工具：使用PNCas9-plant base editor (PBE)系统（融合胞嘧啶脱氨酶与nCas9），通过粒子轰击法（particle bombardment）将编辑载体导入小麦品种科农199（Kenong199）的未成熟胚（~640个）。

1. 突变体筛选与表型验证：

   • TaALS-P174位点编辑：在非选择性MS培养基中再生植株后，通过PCR限制性酶切（PCR-RE）和Sanger测序鉴定编辑事件。16株T0代植株（2.5%）携带碱基编辑突变，其中10株为无转基因成分的纯合或双等位突变。
     
   • 除草剂耐受性测试：
     
     • 体外筛选：将T0幼苗转移至含0.25 mg/L烟嘧磺隆（nicosulfuron，SU类）的培养基，10株表现耐受，其携带≥3个等位基因突变（如五等位突变体Aaf/fBbf/sDds/s）。
       
     • 田间模拟：T2代纯合突变体在40 g/ha烟嘧磺隆处理下正常生长，而野生型（WT）30天内死亡。耐受性与等位基因数量正相关（如六等位突变体Aas/sBbs/sDdf/f耐受性最强）。
       

2. 共编辑系统开发：

   • 双靶点编辑：将TaALS-P174与TaALS-G631（IMI耐受位点）的sgRNA共表达载体导入~1200个胚，通过烟嘧磺隆筛选获得50株存活植株，其中54%携带G631位点额外编辑（如G631D/G632S双突变）。
     
   • 扩展应用：该系统还成功用于TaALS-E101、TaALS-D181及TaACCase-A1992（赋予quizalofop耐受性）的共编辑，效率提升9-31倍。
     

3. DNA-free编辑验证：

   • 通过体外转录mRNA（PBE和sgRNA）递送，获得4株无DNA整合的突变体，证明RNA介导的碱基编辑可行性。
     

四、主要研究结果
1. 多重除草剂耐受性：
- SU类：六等位突变体（Aas/sBbs/sDdf/f）耐受117 g/ha甲基二磺隆（9倍田间推荐剂量），而WT在39 g/ha即表现药害。
- IMI类：双突变体（P174-Aaf/fBbf/fDds/s + G631-G632S）在108 g/ha咪草酯（imazapic）处理下完全耐受，且耐受性高于传统化学诱变材料PI653509（仅D亚基因组S630N突变）。
- APP类：TaACCase-A1992V突变体耐受10 g/ha quizalofop，为小麦田禾本科杂草防控提供新工具。

1. 共编辑系统的优势：
   
   • 烟嘧磺隆筛选显著富集共编辑事件（如TaALS-P174+G631共编辑频率达54%），且33-75%的T0植株无转基因残留。
     

五、研究结论与价值
1. 科学意义：
- 首次在小麦中通过碱基编辑实现多重除草剂耐受性状的非转基因叠加，为多倍体作物精准编辑提供范例。
- 开发的TaALS-P174选择标记系统可高效富集共编辑事件，推动碱基编辑在作物改良中的应用。

1. 应用前景：
   
   • 耐受短残效期除草剂（如SU类）的小麦品种适合多熟制农业区，减少药害风险。
     
   • 叠加不同作用机制的耐受性状可延缓杂草抗性演化。
     

六、研究亮点
1. 技术创新：
- 首次将碱基编辑用于六倍体小麦的多等位基因同步修饰，克服传统育种耗时且效率低的瓶颈。
- 开发DNA-free编辑方案，符合转基因监管趋势。

1. 发现突破：
   
   • 揭示TaALS-P174S突变对SU类除草剂的耐受性优于P174A，且亚基因组间表达偏好影响表型。
     
   • 发现TaALS-G631位点的11种氨基酸变异类型，拓展了IMI耐受的基因型资源。
     

七、其他价值
研究通过CasOT软件分析潜在脱靶位点（最多3个碱基错配），未检测到脱靶事件（补充图6-8），证实编辑系统的特异性。此外，该策略可推广至其他作物，因*ALS*基因在植物中高度保守。

（注：全文数据可通过原文或通讯作者获取，序列信息参见Ensembl数据库编号TraesCS6A02G288000等。）