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本研究由Christopher J. Johnson、Florian Razy-Krajka、Fan Zeng、Katarzyna M. Piekarz、Shweta Biliya、Ute Rothbächer及Alberto Stolfi等人完成，主要研究机构包括美国佐治亚理工学院生物科学学院、奥地利因斯布鲁克大学动物学系以及佐治亚理工学院分子进化核心实验室。该研究成果于2024年3月13日发表在期刊 PLOS Biology 上，文章标题为“Specification of distinct cell types in a sensory-adhesive organ important for metamorphosis in tunicate larvae”。

本研究的学术背景聚焦于被囊动物（tunicates）幼体发育与变态过程中的细胞分化机制。被囊动物是脊椎动物的姊妹群，大多数海鞘类物种具有双相生活史，即先经历可游动的幼体阶段，再变态为固着生活的成体。幼体的主要功能是分散物种，而幼体附着和变态的关键器官是位于前端的乳突（papillae）。乳突由多种细胞类型组成，包括具有感觉功能的乳头神经元（papilla neurons，PNs）、可分泌黏附物质的胶质细胞（collocytes），以及位于中央的轴柱细胞（axial columnar cells，ACCs）。尽管先前研究已通过电子显微镜和单细胞RNA测序（scRNAseq）对这些细胞进行了初步描述，但其分子调控网络和细胞命运决定机制仍不清楚。本研究的核心目标是通过鉴定新的分子标记物和报告基因，系统揭示乳突内不同细胞类型的特化过程，并进一步阐明其在幼体附着和变态中的作用。

在研究方法与流程方面，本研究首先利用已有的 Ciona robusta 全幼体单细胞RNA测序数据进行重新聚类分析，从“palp sensory cells”簇中筛选出多个候选标记基因，并通过mRNA原位杂交和荧光报告质粒验证其在不同乳突细胞类型中的表达模式。研究对象为 *Ciona robusta*（A型）和 *Ciona intestinalis*（B型），胚胎在体外受精后经电穿孔导入质粒。实验过程中使用了多种组织特异性启动子（如*foxc*、*islet*、*foxg*）驱动的CRISPR/Cas9基因敲除系统，以及U6启动子驱动的单链引导RNA（sgRNA）表达载体。同时，利用药理学抑制剂U0126（MEK抑制剂）和DMH1（BMP抑制剂）处理胚胎以干扰特定信号通路。在基因功能验证中，采用了组织特异性CRISPR/Cas9介导的突变、cDNA rescue实验以及荧光报告基因共表达分析。此外，研究还使用了PNA（花生凝集素）染色以检测黏附物质颗粒，并通过bulk RNA测序比较不同*islet*扰动条件下的差异表达基因。定量图像分析方面，使用LAS X和ImageJ软件测量乳突细胞长度和荧光强度比值。

研究结果首先揭示了乳突包含至少五类细胞，分别为ACCs、内胶质细胞（inner collocytes，ICs）、外胶质细胞（outer collocytes，OCs）、PNs以及乳突周围基底细胞。通过原位杂交和报告质粒，研究者发现*islet*阳性细胞位于乳突核心，而*sp6/7/8*在周围细胞中表达。CRISPR敲除实验表明，*islet*是ACCs和ICs特化所必需的，但对OCs和PNs无显著影响。进一步通过过表达*sp6/7/8*可抑制ACC命运并诱导IC命运，而单独过表达*sp6/7/8*则促进OC命运。这表明ACCs（仅需*islet*）、ICs（islet + *sp6/7/8*）和OCs（仅需*sp6/7/8*）的命运选择依赖于*islet*与*sp6/7/8*的组合逻辑。PNA染色显示ICs主要在其顶端分泌强阳性黏附物质，而OCs胞内含有较多PNA阳性颗粒，提示两者均参与黏附胶的产生，但ICs可能贡献更大。

关于PNs和OCs的起源，研究发现它们均来源于最初表达*foxg*但随后下调该基因的细胞。通过U0126处理抑制MAPK信号可扩展*islet*表达域并同时消除PN和OC报告基因表达，说明这些细胞来自MAPK依赖的*foxg*下调细胞群。PNs的特化还依赖于*Pou4*，其敲除导致PN报告基因表达丢失，但不影响ACCs或OCs。Notch信号在此过程中发挥PN与OC命运选择的作用：过表达显性负突变体*suh-dbm*导致OC报告基因表达丧失，同时PNs数目增加，表明Delta/Notch信号在神经发生中限制PN数量并促进OC形成。

在形态发生方面，*islet*的敲除导致乳突形态异常，表现为细胞顶端变钝、顶基底轴长度缩短。通过bulk RNA测序筛选出多个受*islet*调控的候选靶基因，包括*villin*和*tuba3*。其中*villin*编码一种肌动蛋白调节蛋白，其表达在中央乳突细胞中富集，*islet*过表达可上调其表达，而*islet*敲除则降低其表达。然而，单独敲除*villin*或*tuba3*并未一致地改变ACC长度，提示乳突形态发生可能由多个下游效应基因协同调控。

在变态功能研究方面，研究者利用组织特异性CRISPR敲除不同转录因子并观察尾部回缩（tail retraction）和身体旋转（body rotation）两个关键变态步骤。*Pou4*敲除几乎完全阻断两个过程，表明PNs对于触发变态至关重要。*islet*敲除不影响尾部回缩，但部分损害身体旋转，提示ACCs或ICs可能在变态后期步骤中发挥作用。*foxg*敲除则导致部分个体出现“带尾幼体”（tailed juveniles），即身体旋转发生但尾部未回缩，表明*foxg*的缺失可使两个过程解偶联。*sp6/7/8*敲除对变态无明显影响。

本研究的结论是，乳突内不同细胞类型的特化由*islet*、*sp6/7/8*、*Pou4*、*foxg*以及Notch和MAPK信号通路共同调控。该工作首次系统建立了乳突细胞类型特化的分子网络，并为后续研究被囊动物幼体附着和变态的细胞学基础提供了丰富的遗传工具和标记物。研究不仅推进了对被囊动物发育生物学的理解，也为探索黏附器官的进化与功能提供了新视角。

本研究的亮点包括：鉴定并验证了多个新的细胞类型特异性标记基因和报告质粒；利用组织特异性CRISPR/Cas9系统在特定谱系中进行基因敲除，避免了全身性敲除的致死效应；通过PNA染色结合基因扰动实验直接证明了两类胶质细胞在黏附物质分泌中的不同贡献；首次揭示了Notch信号在PN与OC命运选择中的作用。此外，研究还发现*foxg*敲除可导致尾部回缩与身体旋转的解偶联，为理解变态过程的调控提供了新的实验模型。所有原始测序数据均已公开，便于后续研究者进一步分析。