2026年，中国四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室的研究团队在*Nature Communications*杂志上发表了一项重要的原创性研究。该研究的通讯作者为Yamei Yu、Qiang Chen和Zhiyong Zong，共同第一作者为Rui Liu、Dongmei Tang和Mingze Niu。该工作报道了一种全新的细菌防御系统，该系统能够特异性靶向噬菌体基因组DNA中修饰的胞嘧啶，并将其命名为Cmore（胞嘧啶修饰限制性内切酶）。
这项研究的科学领域聚焦于细菌与噬菌体（即感染细菌的病毒）之间永恒且激烈的“进化军备竞赛”。在这一背景下，细菌进化出多种多样的抗病毒防御系统以对抗噬菌体感染，而噬菌体则相应地发展出反防御策略来逃避或破坏这些系统。其中，限制修饰系统是细菌中最普遍、最经典的防御机制之一。它包含甲基化酶和限制性内切酶两个组分，前者对细菌自身的DNA进行甲基化修饰以标记“自我”，后者则切割未经修饰的“非我”噬菌体DNA。T-偶数噬菌体等进化出了一种巧妙的逃逸策略：它们用5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmc）或其葡萄糖基化形式（5-glucosylated hmc, 5ghmc）完全替代其基因组中的普通胞嘧啶，从而逃避依赖甲基化识别的经典限制修饰系统的攻击。同时，5hmc也是哺乳动物中重要的表观遗传修饰，被称为“第六碱基”，其异常水平与多种癌症和神经系统疾病密切相关。然而，在基因组水平上高特异性地检测低丰度的5hmc是一个重大技术挑战。本研究旨在鉴定并深入解析一种能特异性靶向这些修饰胞嘧啶的细菌防御系统，这不仅有助于揭示细菌-噬菌体军备竞赛的新层面，也可能为开发高特异性的表观遗传检测工具提供新的思路。
本研究遵循了一个从功能表征到结构机制再到应用前景探索的详细工作流程，涵盖了多个相互关联的实验步骤。
第一部分：系统功能鉴定与抗噬菌体活性验证。 研究团队首先从三个不同的细菌菌株（包括两株大肠杆菌和一株肺炎克雷伯菌）中克隆了编码Cmore系统（最初称为pd-t4-3）的基因，并将其构建到表达载体上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。这些细菌本身不具备该防御系统。研究目标旨在测试Cmore是否能为宿主提供抗噬菌体保护。通过“噬斑形成效率”测定实验，研究人员用一系列噬菌体（T1至T7以及P1）挑战携带Cmore系统的菌株。结果表明，Cmore系统能够特异地、高效地保护细菌抵抗T2、T4和T6这些T-偶数噬菌体的感染，使噬菌体的噬斑形成效率降低约5个数量级。当使用高感染复数进行液体培养感染实验时，携带Cmore系统的细菌生长未受影响，表明其通过直接的防御机制（即降解噬菌体DNA）而非流产感染机制起作用。
第二部分：核酸酶底物特异性分析。 基于Cmore特异性针对T-偶数噬菌体的现象，研究人员推测其可能识别并降解含有5hmc或5ghmc修饰的DNA。为验证这一假说，他们纯化了Cmore蛋白，在体外评估其核酸内切酶活性。实验使用了多种噬菌体的基因组DNA作为底物，结果显示Cmore能够特异性降解T-偶数噬菌体（含5hmc/5ghmc）的DNA，而对其他不含此修饰的噬菌体DNA无活性。为了更精确地确定修饰类型特异性，研究人员合成了含有不同胞嘧啶修饰（普通C、5-甲基胞嘧啶、5hmc、5ghmc）的PCR扩增产物。体外酶切实验清晰地表明，Cmore仅有效降解含有5hmc或5ghmc的DNA，而对含普通C或5-甲基胞嘧啶的DNA没有可检测的活性。同时，利用噬菌体突变体进行的体内实验进一步证实了这一特异性：Cmore能抵抗基因组仅含5hmc（不含葡萄糖基）的T4噬菌体突变体，但对基因组使用普通胞嘧啶的T4噬菌体突变体完全无效。为理解底物选择性的机制，研究人员采用了电泳迁移率变动分析来检测Cmore与不同修饰DNA的结合能力。结果显示，Cmore仅与5hmc或5ghmc修饰的DNA结合，而不与普通或5-甲基胞嘧啶修饰的DNA结合，这从结合亲和力的角度解释了其酶切特异性。
第三部分：酶切模式与结构解析。 为了阐明Cmore如何切割DNA，研究人员对经Cmore消化后的T4噬菌体基因组DNA片段进行了高通量测序分析。通过对消化产物的末端进行测序和比对，他们确定了Cmore的切割位点模式。数据分析发现，Cmore在DNA双链上产生一个对称的切割位点，其共有序列为CN11/N9G，即切割发生在修饰的胞嘧啶（C）下游第11个碱基（同一条链上）和第9个碱基（互补链上）的位置，产生带有2个核苷酸3‘-突出的末端。这一对称模式暗示Cmore可能以二聚体形式发挥作用。接下来，研究进入了结构生物学阶段，以深入理解其作用机制。研究人员解析了来自两株大肠杆菌的Cmore蛋白的晶体结构，分辨率分别为2.2埃和2.8埃。结构显示Cmore是一个双结构域蛋白：N端为GIY-YIG核酸内切酶催化结构域，C端为功能未知的结构域（后被证实为修饰感应结构域），两者由一个柔性连接子连接。结构比对发现，Cmore的GIY-YIG结构域具有两个独特特征：其一，其“GIY-YIG”基序中插入了第三个酪氨酸残基，形成了“GIYXY-YIG”基序；其二，催化结构域中存在一个富含负电荷氨基酸的插入环，该环像盖子一样覆盖在活性位点上方。为了探究这个负电环的功能，研究人员构建了突变体（将四个连续的负电荷氨基酸突变为丙氨酸，称为4A突变体）。功能实验表明，与野生型蛋白相比，该突变体对T4 DNA的酶切活性更高，甚至获得了降解普通DNA的微弱能力，且表达该突变体的细菌表现出生长抑制和细胞毒性。这证实了该负电环起到一种“自抑制”作用，通过电荷排斥来防止非特异性底物结合和宿主DNA损伤，从而确保了系统的特异性。
第四部分：寡聚化组装与底物识别机制。 晶体结构还揭示了Cmore在溶液中形成四聚体（两个头对尾的二聚体以背对背方式组装）。为了验证四聚体组装对其功能的重要性，研究人员设计了针对二聚体内部界面和四聚体界面相互作用的突变体。抗噬菌体实验和分子排阻色谱分析表明，破坏四聚体组装的突变体完全丧失了抗噬菌体功能，证实了这种高级结构对于Cmore发挥抗病毒作用是必需的。为了揭示Cmore如何“看见”修饰的胞嘧啶，研究人员解析了Cmore与5-羟甲基-dCTP（5hm-dCTP，即5hmc的核苷三磷酸形式）的复合物晶体结构。结构清楚地显示，5hm-dCTP结合在C端结构域的一个特定位置，其5-羟甲基基团与蛋白质主链形成氢键。结构比较表明，这种识别模式类似于哺乳动物蛋白UHRF2的SRA结构域识别从DNA双链中翻转出来的5hmc的方式。结合之前发现的对称切割位点（两个5hmc位点相距21个碱基对，约71埃），研究人员推测，一个Cmore二聚体负责识别DNA底物上的两个对称分布的5hmc位点，而整个四聚体则可能同时结合并处理两个DNA分子。
第五部分：进化分布与潜在应用。 最后，研究人员使用生物信息学工具在大量原核生物基因组中搜索了Cmore同源系统，在274个细菌基因组中鉴定出该系统的存在，表明其在不同细菌类群中广泛分布。根据结构域组成，可将这些系统分为四种类型。所有这些同源蛋白都保留了独特的“GIYXY-YIG”基序和负电自抑制环，因此Cmore代表了一个新的GIY-YIG家族成员。鉴于其高特异性地识别和切割5hmc/5ghmc（而非结构相似的5-甲基胞嘧啶）的特性，以及相对于已知5hmc检测工具PvuRts1I而言Cmore蛋白更稳定、耐受性更好，研究团队提出Cmore有潜力作为一种新型工具，用于哺乳动物基因组中5hmc的精准检测和定位，这在表观遗传学研究和疾病诊断方面具有重要意义。
本研究获得的主要结果层层递进，逻辑严密：1）体内抗噬菌体实验证实了Cmore系统对T-偶数噬菌体的特异性防御功能；2）体外酶切实验和结合实验明确了其底物为5hmc/5ghmc修饰的DNA，从而解释了其抗病毒特异性的分子基础；3）酶切模式分析揭示了对称的、依赖于两个修饰位点的切割方式，为理解其功能单元（二聚体）提供了线索；4）晶体结构解析揭示了其独特的双结构域架构、寡聚化状态以及“GIYXY-YIG”基序和自抑制环这两个新颖的结构特征；5）结构-功能关联研究（如负电环突变和寡聚化界面突变）直接验证了这些结构特征在调控酶活性和维持功能完整性中的关键作用；6）复合物结构直观展示了修饰胞嘧啶的结合位点和方式，阐明了识别的结构基础。这些结果最终共同支撑起一个完整的防御机制模型：Cmore作为一种IV型修饰依赖性限制性内切酶，其C端结构域特异性感应噬菌体DNA上的5hmc/5ghmc修饰，解除或绕过N端结构域负电环的自抑制，进而通过其GIY-YIG催化中心降解入侵的病毒基因组，而其高底物亲和力与自抑制机制的结合确保了宿主自身DNA的安全。
本研究的结论明确而富有价值。首先，从基础科学角度看，它揭示了一种全新的细菌抗噬菌体防御范式：Cmore系统不再像经典限制修饰系统那样攻击“未修饰”的DNA，而是反其道而行之，主动攻击那些因逃避经典系统而“过度修饰”（羟基化和糖基化）的噬菌体DNA。这生动地展现了细菌与噬菌体之间复杂而精妙的进化博弈，即在经典的“修饰-反修饰”基础上，又增加了一层“反-反修饰”的攻防维度。其次，研究鉴定了一个全新的限制性内切酶家族成员（GIY-YIG家族），并阐明了其独特的结构特征（“GIYXY-YIG”基序和自抑制环）与功能机制，丰富了我们对核酸酶结构和功能多样性的认识。最后，从应用价值看，Cmore展现出了作为一种高特异性、高性能分子工具的潜力。其在区分5hmc和5-甲基胞嘧啶方面的优异表现，使其有望克服现有表观遗传检测方法中的交叉反应性问题，为开发新一代用于癌症、神经退行性疾病等的表观遗传标志物检测和基因组图谱绘制技术提供了新的候选“利器”。
本研究的亮点在于：1）重要发现的新颖性：发现并证实了一种以前未被认识的、靶向修饰胞嘧啶的细菌防御系统，拓展了抗噬菌体防御系统的已知范畴。2）研究方法的系统性和深入性：整合了遗传学、生物化学、结构生物学和生物信息学等多学科手段，从表型到功能，从结构到机制，进行了全面且深入的解析，工作流程完整严谨。3）结构-功能关联的深刻揭示：不仅解析了蛋白质的静态结构，更通过巧妙的突变体设计和功能实验，明确了“GIYXY-YIG”基序、负电荷自抑制环以及四聚体组装等独特结构特征的具体生物学功能，将结构信息与分子机制紧密相连。4）潜在的跨领域应用价值：敏锐地指出了该系统在生物技术和医学诊断领域的潜在应用前景，将一项基础微生物学研究与更广泛的生物医学问题联系起来，提升了研究的整体影响力。