《yeast》期刊研究报告：热带假丝酵母（Candida tropicalis）的DNA转化系统开发

作者与机构
本研究由瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH-Hönggerberg）生物技术研究所的Dominique Sanglard*和Armin Fiechter合作完成，发表于1992年《yeast》第8卷第1065-1075页。

学术背景

研究领域
本研究属于微生物遗传学与分子生物学领域，聚焦于热带假丝酵母（Candida tropicalis）的遗传操作工具开发。热带假丝酵母是一种非孢子形成的酵母，具有代谢多样性（如利用烷烃、木糖等非传统碳源）和潜在的工业应用价值（如异源蛋白表达）。

研究动机
尽管热带假丝酵母的代谢途径（如烷烃诱导的细胞色素P450单加氧酶）已被广泛研究，但其遗传操作工具（如转化系统）的缺乏限制了分子遗传学研究的深入。此前，热带假丝酵母的转化仅依赖同源重组整合载体，效率低且无法实现自主复制。本研究旨在开发复制型（replicative）和整合型（integrative）载体并优化转化流程，为基因功能研究（如基因敲除）和生物技术应用奠定基础。

研究流程与实验方法

1. 受体菌株构建

• 目标：获得稳定的腺嘌呤营养缺陷型（ade2）突变体作为转化受体。
  
• 方法：
  
  • 通过紫外线（UV）诱变和制霉菌素（nystatin）富集筛选，获得初始ade2突变体（HA900）。
    
  • 二次UV诱变降低回复突变率（<10⁻⁷），并通过原生质体融合实验验证其ade2表型（与已知ade1菌株互补）。
    

2. 异源复制型载体（pmk16）转化

• 载体特性：pmk16含白色念珠菌（C. albicans）的ade2基因和自主复制序列（CARS, Candida Autonomously Replicating Sequence）。
  
• 转化流程：
  
  • 原生质体制备：用zymolyase消化细胞壁，聚乙二醇（PEG）介导DNA导入。
    
  • 转化效率：10²–3×10²转化子/μg DNA，与白色念珠菌相当。
    
  • 表型分析：
    
  • 粉红色转化子：质粒易丢失（非选择性培养下稳定性<10%）。
    
  • 白色转化子：质粒稳定性高（50–60%保留），但未整合至基因组。
    
  • 质粒拯救：从转化子中回收pmk16，发现白色转化子以单体形式存在，粉红色转化子以多聚体形式存在。
    

3. 同源整合型载体（pade2）开发与转化

• 载体构建：
  
  • 克隆热带假丝酵母的ade2基因（12 kb SalI片段），插入酵母穿梭载体pEMBLYe31。
    
  • 通过亚克隆确定最小功能片段（3.5 kb EcoRV片段）。
    
• 转化结果：
  
  • 效率低（10–20转化子/μg DNA），但转化子稳定性极高（非选择性培养下无丢失）。
    
  • Southern blot分析：
    
  • pade2通过同源重组整合至ade2基因座，存在单等位基因整合、双等位基因整合及串联重复整合三种模式。
    
  • 未发现随机整合事件，表明同源重组占主导。
    

4. 数据分析方法

• 分子验证：限制性酶切、Southern blot（探针：pBR322或ade2基因片段）、质粒拯救（电转化至大肠杆菌）。
  
• 稳定性量化：通过非选择性培养后计算表型丢失率。
  

主要结果与逻辑链条

1. pmk16的异源复制性：

   • 在热带假丝酵母中自主复制，但以多聚体形式存在（与白色念珠菌类似）。
     
   • 白色转化子的高稳定性可能与质粒拷贝数降低（15–20 vs. 粉红色的90–120）或单体化相关。
     

2. pade2的同源整合机制：

   • 双等位基因整合频率高（3/5转化子），推测可能因同时整合或后续有丝分裂重组导致。
     
   • 串联重复整合模式表明载体可通过同源重组形成多拷贝。
     

3. 技术对比：

   • 复制型载体适合短期高拷贝表达，整合型载体适合稳定遗传修饰。
     

结论与价值

科学意义：
- 首次在热带假丝酵母中实现复制型载体转化，扩展了其分子遗传学工具包。
- 揭示了质粒多聚化现象在酵母中的普遍性（与汉逊酵母、裂殖酵母等一致）。

应用价值：
- 为基因功能研究（如细胞色素P450基因家族）和工业菌株改造（如蛋白酶分泌优化）提供技术基础。
- 后续研究利用此系统成功敲除了酸性蛋白酶基因（acp），验证了其在基因编辑中的实用性。

研究亮点

1. 创新方法：

   • 结合UV诱变与原生质体融合，稳定化ade2突变体。
     
   • 首次在热带假丝酵母中验证异源CARS元件的功能。
     

2. 关键发现：

   • 质粒多聚化与转化子表型稳定性直接相关。
     
   • 同源整合载体可实现高效位点特异性编辑，避免随机整合的不可控性。
     

3. 技术局限性：

   • 整合型载体效率低（需优化原生质体制备条件）。
     
   • 复制型载体拷贝数调控机制尚不明确。
     

其他有价值内容

• 研究提及热带假丝酵母的二倍体特性，为后续单倍体化或基因剂量研究提供线索。
  
• 对比了不同假丝酵母属（如C. albicans与C. tropicalis）的转化系统差异，为跨物种工具开发提供参考。
  

（注：专业术语如CARS、Southern blot等首次出现时保留英文原词，后文使用中文表述。）