人工构建具有不同转录强度的跨物种启动子
一、 研究作者、机构及发表信息
本研究由江南大学未来食品科学中心的左文杰、尹国斌、张璐瑶、张玮娇、徐瑞瑞、王洋、李江华和康振*共同完成。其中，左文杰和尹国斌为共同第一作者，康振为通讯作者。研究团队主要来自江南大学未来食品科学中心、教育部糖化学与生物技术重点实验室（生物技术学院）以及教育部工业生物技术重点实验室（生物技术学院）。
该研究成果以题为“Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths”的原创研究论文形式，发表于期刊 synthetic and systems biotechnology 第10卷（2025年，第49-57页）。论文于2024年6月4日收到，2024年8月7日被接受，并于2024年8月8日在线发表。
二、 学术背景与研究目标
本研究属于合成生物学领域，具体聚焦于基因表达调控的核心元件——启动子的工程化设计与构建。
研究背景： 启动子是合成生物学中调控基因表达的基础工具，对于实现精确的遗传控制、推动各类生物技术创新应用至关重要。然而，当前大多数基因系统的工程化进展依赖于宿主特异性的调控元件。随着合成生物学底盘细胞种类的日益多样化，迫切需要扩展通用启动子工具库的谱系，以确保其能够适应不同的微生物底盘细胞，从而在快速发展的合成生物学领域中增强应用的普适性和可定制性。尽管针对特定宿主（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等）的启动子工程已取得显著进展，但能够同时覆盖多种原核和真核宿主的、稳健的跨物种启动子研究仍不充分，这使得在多个宿主中筛选或表征基因表达过程变得困难。
研究目标： 本研究旨在解决上述问题，通过分析和整合来自不同微生物的天然启动子核心结构，理性设计和构建一个系列化的、具有不同转录活性的跨物种启动子。具体目标是开发出能在五种典型微生物（包括原核的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌，以及真核的酿酒酵母、毕赤酵母）中均具有功能的启动子，从而显著扩展合成生物学的启动子工具包，并为通用生物元件的标准化开发提供基础和启发。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个系统的合成生物学工程实践，包含多个连续的、逻辑严密的设计、构建与测试环节。研究流程可概括为以下几个主要步骤：
1. 升级原核启动子元件：增强PBS启动子在原核宿主中的活性
研究对象与样本： 以前期研究中开发的、能在三种宿主中工作的广谱启动子PBS为基础序列。首先，针对其在大肠杆菌中的活性进行优化。
流程与方法： * UP元件引入与筛选： 为了提升PBS启动子在大肠杆菌中的活性，研究首先在其上游引入了6个已知能增强启动子活性的UP序列（UP1-UP6）。UP元件是位于转录起始位点上游约-45至-60 bp的序列，能与RNA聚合酶的α亚基羧基末端结构域（αCTD）结合，促进RNA聚合酶对启动子的识别。 * UP元件突变库构建与高通量筛选： 基于活性较好的UP4和UP6序列，研究人员设计了一个UP元件突变库（序列模板：5’-NNANATGANGATCAAAANANANNCNNNNN-3’）。将该突变库与PBS启动子融合，构建了质粒文库，并转化大肠杆菌。随后，利用流式细胞仪（BD FACSaria III）对转化子进行高通量筛选，回收荧光强度最高的0.1%的细胞。 * 验证与优选： 将筛选到的细胞在96孔板中培养，重新检测其绿色荧光蛋白（GFP）的荧光强度。最终，通过测序获得了30个UP突变序列，并从中挑选出活性最强的三个（UP-G1, UP-G2, UP-G3）用于后续研究。这些优化的UP元件作为跨物种启动子的原核增强部分。
2. 整合σ因子结合位点：构建新的跨物种启动子骨架（PST）
研究对象： 以PBS启动子为模板骨架。
流程与方法： * 理性设计： 为了扩展启动子对原核宿主不同σ因子的识别能力，研究人员将来自大肠杆菌的σ54因子结合位点，以及来自枯草芽孢杆菌的σB和σD因子结合位点，理性整合到PBS启动子的框架中。 * 序列整合： 具体操作上，将σ54的识别序列（及其间隔序列）插入到PBS上游激活序列（UAS）的上游；同时，将PBS原有的TATA-N30区域进行突变，以引入σB和σD的保守识别序列。通过这种设计，创造了一个名为PST的新启动子骨架。该设计旨在利用不同细菌σ因子识别序列的相似性和兼容性，增强启动子在多种细菌中的转录活性。 * 活性验证： 将构建的PST启动子分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中测试其驱动GFP表达的活性，并与原始的PBS启动子进行比较。
3. 设计上游激活序列（UAS）：优化启动子在真核宿主中的元件
研究对象： 从毕赤酵母和酿酒酵母的经典强组成型启动子（如GAP、GCW14、AOX1、TDH3）中挖掘有效的转录激活元件。
流程与方法： * 天然启动子活性交叉验证： 首先在酿酒酵母和毕赤酵母中交叉测试了这些天然启动子的活性，确认了启动子活性具有宿主偏好性（例如，TDH3在酿酒酵母中活性远高于在毕赤酵母中）。 * 转录因子结合位点（TFBSs）预测与选择： 利用酵母转录调控跨物种比较基因组学数据库Yeastract+，基于上述活性测试结果，从这些天然启动子序列中预测并选择了11个可能作为转录激活子的TFBSs（如Sip4-Cat8, Gcr2, Abf1, Cat1, Gln3等）。 * 人工UAS序列组装： 开发了一种简单的序列附件算法，将这11个TFBSs进行组合与排列，旨在生成DNA序列信息密度最高的UAS区域。最终产生了11个长度从25到109 nt不等的人工UAS组合序列（命名为UAS1至UAS11）。 * 活性筛选： 将这些人工UAS序列分别连接到PBS启动子的上游，在酿酒酵母和毕赤酵母中验证其增强转录的活性。通过比较不同组合的GFP荧光强度，筛选出在两种酵母中均表现较好的UAS组合（如UAS2, UAS4, UAS5, UAS10, UAS11）。
4. 组合优化与跨物种启动子（PSH）的最终构建
研究对象： 将前述步骤中获得的最佳元件进行组合。
流程与方法： * 元件组合： 将筛选出的最优真核UAS（2, 4, 5, 10, 11号组合）、最优原核UP元件（UP-G1, G2, G3）以及新的原核启动子骨架PST进行组合，产生了15种可能的启动子变体。 * 初步筛选与RBS融合： 对这15种组合进行初步活性测试后，选出了8个表现优异的候选序列。为了进一步提升表达效率，在这8个序列的3‘端融合了一个优化的核糖体结合位点（RBS，序列为5’-AAGGAGGTCTGCAATA-3’，其中包含酵母的Kozak序列）。 * 最终构建与命名： 最终得到了8个跨物种启动子，命名为PSH1至PSH8。 * 系统性功能验证： 将PSH1-8分别导入五种目标微生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母）中，通过荧光显微镜观察和定量检测GFP荧光强度，全面评估其在所有宿主中的活性和强度。同时，与各宿主中常用的强启动子（如大肠杆菌的J23100、枯草芽孢杆菌的P43、谷氨酸棒杆菌的Ptrc、毕赤酵母的PGAP、酿酒酵母的PTEF1）进行活性对比。 * 稳定性测试： 为了验证启动子在真核宿主中的表达稳定性，参考已有方案，在毕赤酵母中进行了长达14天的连续发酵实验，监测GFP荧光表达的稳定性。
四、 主要研究结果
1. UP元件工程显著提升了大肠杆菌中的启动子活性。 引入已知UP序列（UP4和UP6）使PBS启动子活性分别提高了1.4倍和1.6倍。通过突变库筛选获得的新UP元件（UP-G1, G2, G3）进一步将活性提升至PBS的190%到300%。这证实了优化UP元件是构建强启动子的有效策略。
2. 整合多σ因子结合位点成功增强了启动子在原核宿主中的普适性和强度。 新设计的PST启动子骨架，通过整合σ54、σB和σD的结合位点，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的相对荧光强度均达到PBS的约200%（即提升一倍）。即使在未专门针对谷氨酸棒杆菌设计σ因子位点的情况下，PST在该宿主中的活性也提升了约60%。这表明利用来自不同细菌的σ因子保守序列可以有效拓宽和增强启动子在原核宿主中的功能。
3. 人工设计的UAS序列能有效增强启动子在真核宿主中的活性。 活性测试表明，不同的人工UAS组合在两种酵母中表现出不同的增强效果。例如，UAS2、UAS4、UAS5在毕赤酵母中表现出色（相对荧光强度超过800），而UAS10和UAS11在酿酒酵母中活性最强（相对荧光强度超过1400）。这证明了从天然启动子中挖掘并理性组合TFBSs来构建人工UAS的可行性。
4. 成功构建了在五种微生物中均有活性的跨物种启动子系列PSH1-8。 这是本研究最核心的成果。荧光显微镜观察和定量数据均证实，所有8个PSH启动子均能在五种测试菌株中驱动GFP表达。 * 活性强度： PSH系列启动子在不同宿主中展现出有应用价值的活性强度。例如，在大肠杆菌中，其活性最高可达J23100启动子的10倍；在枯草芽孢杆菌中，可达P43启动子的约1.8倍；在谷氨酸棒杆菌中，可达Ptrc启动子（不含诱导调控序列）活性的约80%；在毕赤酵母中，PSH7的活性可达内源GAP启动子的120%；在酿酒酵母中，其活性最高可达TEF1启动子的50%。 * 关键发现： 对比PST骨架和最终PSH的活性发现，融合RBS和人工UAS序列对功能有促进作用。特别地，PSH3、PSH7和PSH8在两种酵母中活性都相对较强。序列分析表明，这些启动子的UAS组合可能产生了新的转录因子结合位点（如GSM1, PIP2, RGT1, OAF1, YRR1等），从而发挥了协同促进作用。 * 稳定性验证： 长期发酵实验表明，PSH启动子在毕赤酵母中能够稳定维持GFP表达超过14天，证明了其在实际应用中的可靠性。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发了一个名为PSH的人工跨物种启动子系列，该系列启动子首次被证明能在五种代表性的原核和真核微生物中均具有转录活性。这标志着在合成生物学通用元件开发方面取得了重要进展。
科学价值： 1. 提供了跨物种启动子设计的新策略： 本研究提出的“组合使用原核和真核启动子的关键元件”策略（整合UP元件、多σ因子结合位点、人工UAS等）为未来启动子工程提供了全新的思路和方法。 2. 丰富了合成生物学工具包： PSH系列启动子显著扩展了合成生物学中可用启动子的范围和多样性，为在多宿主系统中进行基因表达比较、路径优化和底盘细胞筛选提供了标准化、可比较的工具。 3. 为元件标准化奠定基础： 该研究为实现生物元件的标准化、模块化开发提供了实践基础和设计灵感，有助于推动合成生物学向更自动化、高通量的方向发展。
应用价值： 1. 简化多宿主筛选流程： 使用同一套PSH启动子，研究人员可以快速在不同微生物宿主中测试目标蛋白的表达情况，初步筛选出最适合的表达底盘，加速微生物细胞工厂的构建进程。 2. 促进多基因途径的移植与优化： 结合内部核糖体进入位点（IRES）、2A肽等多顺反子表达技术，PSH启动子有望用于在不同宿主中快速组装和调试复杂的代谢途径。 3. 具备工业应用潜力： 特别是在毕赤酵母等工业常用宿主中表现出强而稳定的活性，使得PSH启动子在酶制剂、天然产物等工业生物制造领域具有直接的应用前景。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
论文在讨论部分展望了未来的研究方向，指出尽管当前组合已取得成效，但由于不同菌株乃至不同生物界之间在TFBSs、σ因子识别序列和核心启动子序列上存在差异，当前的组合仍不够全面。例如，人工UAS在酵母中的活性存在差异，这可能源于未知的或新形成的转录因子结合基序，或者识别序列在两种酵母中的效能不同。因此，未来需要进一步扩展真核启动子元件的库容，并在不同培养条件下进行检测。此外，作者提出，结合机器学习方法分析高通量数据，建立考虑启动子活性、序列长度、适用菌株选择等参数的跨物种启动子设计算法，将是实现更全面、标准化基因表达系统的重要方向。这种“湿实验”与“干数据”计算分析相结合的模式，代表了合成生物学元件设计的未来趋势。