本研究的主要作者是于军浩、宋庆鑫、陈浩威、邹宏飞、魏伟、康旭升、马彪、张万科、张劲松和陈受宜，均来自中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因研究中心、国家植物基因组重点实验室。该研究以《植物NAC型转录因子蛋白含有一个用于抑制转录激活的NARD结构域》为题，于2010年8月4日在线发表于学术期刊《Planta》（第232卷，第1033-1043页）。
学术背景 植物特异性转录因子NAC蛋白在植物发育、衰老、形态建成以及胁迫信号转导等众多生物学过程中扮演着关键角色。NAC家族中，部分成员作为转录激活子发挥作用，而另一些则作为抑制子。然而，对于NAC蛋白如何精确调控其转录活性，其分子机制尚不完全清楚。此前研究表明，大豆中的GmNAC20是一个胁迫响应基因，但其全长蛋白在酵母系统中未显示出转录激活活性，而其羧基末端却具有潜在的激活能力，这暗示着该蛋白内部可能存在抑制其激活功能的结构域。因此，本研究旨在探究GmNAC20蛋白转录调控活性的分子基础，特别是鉴定其潜在的转录抑制结构域，并阐明该结构域在NAC家族蛋白功能调控中的普遍性及作用机制。研究目标包括：1）确认GmNAC20的转录激活域和抑制域；2）鉴定抑制域的具体序列特征，并将其命名为NARD（NAC Repression Domain）；3）验证NARD结构域对多种转录因子活性的广谱抑制能力；4）探究NARD结构域在NAC家族中的保守性及其关键功能基序；5）提出NAC蛋白转录调控活性的可能决定模型。
详细研究流程 本研究包含多个相互关联的实验流程，综合运用了分子克隆、酵母单杂交、植物原生质体瞬时表达、序列比对和定点突变等技术。
流程一：基因克隆与初步活性筛选 首先，研究者从大豆叶片中提取总RNA并反转录获得cDNA。基于前期构建的大豆Unigene数据库，他们鉴定出54个NAC样基因，并通过RT-PCR分析了它们在盐、冷、旱等非生物胁迫下的表达模式。从中筛选出三个胁迫响应基因：GmNAC11（受盐和干旱诱导）、GmNAC20和GmNAC35（均受冷、盐和干旱诱导）。通过RT-PCR克隆了这三个基因的全长编码序列。序列分析显示，三者均包含N端保守的NAC DNA结合结构域（可进一步划分为A-E五个亚结构域）和C端高度可变的区域。系统发育分析将GmNAC11归类于NAP亚组，GmNAC20归于ATAF亚组，GmNAC35归于NAC1亚组。随后，将这三个基因的全长编码区分别与酵母GAL4 DNA结合域（BD）融合，构建成pBD-GmNACs融合表达载体，转化至含有HIS3和LacZ报告基因的酵母菌株YRG-2中。通过在缺乏组氨酸的培养基（SD/-His）上的生长状况以及X-gal显色反应检测β-半乳糖苷酶活性，评估其转录激活能力。结果表明，GmNAC11和GmNAC35具有转录激活活性，而全长GmNAC20则没有。
流程二：GmNAC20结构域的功能剖析 鉴于全长GmNAC20无活性而其C端可能具有激活域，研究者进行了系统的截短分析。他们将GmNAC20的N端DNA结合域（1-175位氨基酸，1/175）和C端区域（162-268位氨基酸，162/268）分别与GAL4 BD融合，在酵母中进行测试。结果显示，C端区域（162/268）具有强烈的转录激活活性，而N端区域（1/175）则没有。这提示全长蛋白中可能存在一个抑制域，阻断了C端激活域的功能。为了定位这个抑制域，他们构建了一系列包含C端激活域及不同长度N端延伸片段的融合蛋白（141/268， 100/268， 49/268）进行测试。发现141/268仍保留部分活性（约为162/268的50%），而100/268和49/268则完全丧失了活性，表明抑制功能可能位于100-140位氨基酸区域。为了进一步精确定位，他们又将N端的不同片段（1-61， 55-106）与162/268融合，发现这些片段不能抑制激活活性。最后，将100-134位氨基酸片段（共35个氨基酸）与162/268融合，该融合蛋白的转录激活活性被完全抑制。通过ONPG定量分析β-半乳糖苷酶活性以及RT-PCR验证各融合基因在酵母中的表达水平，确认了抑制效应并非由表达量差异引起。因此，他们将GmNAC20中第100-134位氨基酸定义为NAC抑制结构域（NARD）。该区域主要位于NAC DNA结合域的D亚结构域内。
流程三：NARD结构域的广谱抑制功能验证 为了检验NARD结构域抑制功能的普适性，研究者在两个系统中进行了测试。首先，在酵母系统中，将NARD结构域融合到来自不同家族的转录因子（大豆的GmDof4、拟南芥的DREB1A/CBF3、大豆的GmWRKY53以及GmNAC11）的N端。这些转录因子本身在酵母系统中均能激活报告基因表达。融合NARD后，所有转录因子的激活活性均被显著降低，表明NARD能够跨家族抑制转录激活。其次，在更接近植物体内环境的拟南芥叶肉原生质体瞬时表达系统中进行了验证。他们构建了以5×GAL4 UAS驱动萤火虫荧光素酶（LUC）基因的报告质粒，以及一系列效应因子质粒：GAL4 DNA结合域（BD，阴性对照）、BD-VP16（强激活域，阳性对照）、BD-VP16-VP16（两个VP16串联，作为蛋白相互作用对照）、BD-NARD-VP16和BD-VP16-NARD。共转染实验显示，VP16能强烈激活报告基因表达，而无论在N端还是C端融合NARD，都能抑制80%以上的VP16激活活性，证明NARD在植物细胞中同样是一个有效的转录抑制模块。
流程四：NARD结构域在NAC家族中的保守性与功能验证 通过序列比对，研究者在GmNAC11、拟南芥的ATNAC2、NST1、ATAF1、RD26以及水稻的SNAC等NAC蛋白的对应区域中，均发现了与GmNAC20 NARD高度相似的序列，其中17个氨基酸残基完全保守，12个高度保守，因此将核心NARD样序列缩短为29个氨基酸。他们将来自这些蛋白的NARD样序列分别与VP16激活域融合，并在拟南芥原生质体中进行测试。结果表明，所有这些NARD样序列都能显著抑制VP16的转录激活活性，说明NARD介导的抑制功能在NAC家族成员中是保守的。
流程五：NARD结构域关键功能基序的突变分析 为了鉴定NARD结构中负责抑制功能的关键氨基酸基序，研究者首先进行了截短分析。将NARD（1-35）的不同片段（如1-9， 1-12， 1-16， 1-22， 23-35）与GmNAC20的激活域（20AD）融合，在酵母系统中测试其抑制能力。结果显示，全长NARD几乎完全抑制20AD活性；NARD(1⁄22)的抑制能力强于NARD(23⁄35)；而NARD(1⁄16)的抑制效果最强，达到全长NARD抑制效果的约70%，表明关键功能区域位于前16个氨基酸内。进一步，他们对NARD中高度保守的残基进行了定点突变，构建了三个突变体：NARDm1（第9、10位的赖氨酸突变为丙氨酸，K9A， K10A）、NARDm2（第12-15位的亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸全部突变为丙氨酸，LVFY12-15 to AAAA）和NARDm3（将同样的LVFY突变为天冬氨酸，LVFY12-15 to DDDD）。将这些突变体与VP16融合，在原生质体系统中测试。结果显示，NARDm1的抑制功能与野生型NARD无差异；而NARDm2的抑制功能显著减弱，NARDm3减弱得更为明显。这表明LVFY基序，特别是其疏水特性，对于NARD的抑制功能至关重要。
主要研究结果 1. 鉴定出具有差异转录活性的GmNAC蛋白：酵母激活实验表明，GmNAC11和GmNAC35是转录激活子，而全长GmNAC20不具有转录激活活性。 2. 发现并精确定位了GmNAC20内部的转录抑制结构域NARD：通过系统的截短实验，确定GmNAC20的C端（162-268）是一个强转录激活域，而其N端100-134位氨基酸（位于NAC DNA结合域的D亚结构域）是一个活跃的抑制结构域，命名为NARD。该结构域能够完全抑制其自身C端激活域的活性。 3. 证实NARD具有广谱的转录抑制功能：NARD结构域不仅能抑制同源NAC蛋白的激活域，当融合到其他家族转录因子（Dof、WRKY、AP2/DRE）的N端时，也能有效抑制它们的转录激活活性。在植物原生质体系统中，NARD同样能强烈抑制外源强激活域VP16的活性。 4. 证明NARD样结构域在NAC家族中保守且具有功能：序列比对显示，NARD样序列存在于多个NAC家族成员中。功能实验证实，来自GmNAC11、ATNAC2、NST1、ATAF1、RD26和SNAC的NARD样序列均能抑制VP16的活性，说明这是一种保守的调控机制。 5. 鉴定出NARD功能的关键疏水基序LVFY：截短和定点突变分析表明，NARD的抑制功能主要依赖于其N端区域，其中第12-15位的LVFY疏水基序至关重要。将该基序突变为亲水性氨基酸会显著削弱抑制能力，表明疏水相互作用在抑制功能中发挥部分作用。
这些结果环环相扣：从发现GmNAC20全长无活性而C端有活性这一矛盾现象出发，通过截短分析定位到抑制域NARD；随后通过跨家族融合实验证明了NARD抑制功能的广谱性；接着通过序列比对和功能实验将这一发现推广到整个NAC家族；最后通过精细的突变分析揭示了其关键功能基序。每一步的结果都为下一步的研究提供了逻辑基础和方向。
研究结论与意义 本研究得出结论：植物NAC型转录因子蛋白中普遍存在一个位于DNA结合域D亚结构域内的保守抑制结构域——NARD。该结构域能够有效抑制转录激活，其功能部分依赖于一个保守的疏水LVFY基序。研究者提出一个核心假设：NAC蛋白最终的转录调控活性（表现为激活或抑制）可能取决于其C端激活域与N端NARD抑制域之间的相互作用平衡。如果激活域的作用强于抑制域，该蛋白表现为激活子；反之则表现为抑制子；若两者作用相当，其最终功能可能取决于具体的细胞环境或共调节因子。
这项研究的科学价值在于： 1. 机制创新：首次在NAC转录因子家族中系统鉴定并表征了一个保守的转录抑制结构域（NARD），揭示了NAC蛋白除了通过可变C端结构域进行调控外，其保守的DNA结合域内部也蕴藏着关键的调控模块，深化了对这类重要转录因子功能调控机制的理解。 2. 模型提出：提出了一个解释NAC蛋白功能多样性的新模型，即其激活/抑制状态可能由内部激活域与抑制域的动态博弈决定，这为理解同一家族成员为何功能迥异提供了新的理论框架。 3. 工具开发：鉴定出的NARD结构域本身可以作为一个新的转录抑制模块，未来可能应用于合成生物学或植物基因工程中，用于精确下调目标基因的表达。
研究亮点 1. 重要的发现：发现并证实了NAC蛋白DNA结合域内部存在一个此前未被认识的、功能活跃的抑制结构域（NARD），挑战了“NAC域仅负责DNA结合”的传统认知。 2. 严谨的论证：研究从单个蛋白（GmNAC20）的异常表型出发，通过精细的遗传学和生物化学手段（截短、融合、突变）逐步解析其分子基础，并将结论通过序列比对和功能实验推广到整个蛋白家族，论证逻辑严密、证据链完整。 3. 方法的综合性：研究巧妙地结合了酵母遗传学系统（便于快速筛选和定量）和植物原生质体瞬时表达系统（更接近植物体内真实环境），从不同层面验证了NARD的功能，增强了结论的可靠性。 4. 机制的深入探究：不仅定位了NARD，还通过突变分析初步揭示了其发挥功能的关键氨基酸基序（LVFY）及其疏水特性，为后续研究其作用机理（如是否通过干扰DNA结合、核定位或招募共抑制子）奠定了基础。
其他有价值的内容 文章在讨论部分将NARD与已知的其他类型转录抑制域（如富含丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸的结构域以及EAR基序）进行了比较，指出NARD在序列上具有独特性，但同样含有较高比例（37.6%）的疏水氨基酸，这与一些已知抑制域的特征相符。作者还结合已发表的NAC蛋白结构信息，推测NARD区域对应于β-折叠片4a/b和5a/b，这些结构可能参与DNA结合，因此NARD的抑制作用也可能源于对DNA结合的干扰。此外，该区域包含预测的核定位信号（NLS），提示其可能也影响蛋白的核转运。这些讨论为理解NARD的作用机制提供了多个潜在的研究方向。