藜麦全长转录组测序揭示冷胁迫对可变剪接的影响

作者及机构
本研究由山东师范大学山东省植物抗逆重点实验室的Ling Zheng、Yiwu Zhao（共同第一作者）、Yanxiu Zhao和Changle Ma（共同通讯作者）团队主导，合作单位包括中国科学院上海植物生理生态研究所。研究成果于2022年5月20日发表于国际期刊*International Journal of Molecular Sciences*（DOI: 10.3390/ijms23105724），主题为冷胁迫下藜麦可变剪接的调控机制。

学术背景
藜麦（*Chenopodium quinoa*）是一种耐寒且营养丰富的作物，但其耐寒分子机制尚不明确。冷胁迫会抑制光合作用、减少水分吸收并积累活性氧（ROS，Reactive Oxygen Species），破坏植物生理稳态。此前研究已在水稻、高粱等作物中揭示了冷响应基因（如CBFs转录因子）的作用，但藜麦的冷响应转录组特征及可变剪接（Alternative Splicing, AS）的调控作用未见报道。本研究旨在通过牛津纳米孔技术（ONT，Oxford Nanopore Technologies）全长转录组测序，比较耐冷品种CRQ64与冷敏感品种CSQ5的差异，揭示藜麦耐冷的分子机制。

研究流程与方法
1. 材料处理与生理分析
- 样本设计：选取CRQ64和CSQ5种子，在22°C培养3天后，一组转移至4°C（冷处理24小时），另一组保持22°C作为对照。
- 生理指标测定：测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）等活性，验证CRQ64的耐冷性显著优于CSQ5（如CRQ64的SOD活性提高30%，MDA含量降低20%）。

1. ONT全长转录组测序

   • 文库构建：提取总RNA，使用ONT技术生成平均长度862–1158 bp的reads，共获得约910万条高质量序列。
     
   • 数据比对与注释：通过Minimap2比对藜麦参考基因组，发现92.3%的已知基因和44.6%的异构体被覆盖，同时鉴定出6432个新基因和55,389个新异构体（如与拟南芥*AtGLK1B*同源的新基因ONT.27530）。
     

2. 差异表达与可变剪接分析

   • 差异表达基因（DEGs）：CRQ64中冷胁迫特异性DEGs（2393个）富集于蔗糖代谢、苯丙烷生物合成等通路（如β-呋喃果糖苷酶基因表达上调2.5倍）。
     
   • 可变剪接事件：内含子保留（IR，占32.8%）和外显子跳跃（ES，占30.9%）是主要AS类型；CRQ64中537个基因发生差异AS（DAS），如过氧化物酶基因*AUR62037683*的IR事件导致编码框移位。
     

3. 转录因子与lncRNA分析

   • 转录因子（TFs）：鉴定5988个TF基因，其中374个在CRQ64中差异表达（如CBF同源基因*AUR62021242*上调3倍）。
     
   • 长链非编码RNA（lncRNA）：发现2956个lncRNA，其中313个在CRQ64中差异表达，其靶基因富集于磷脂酰肌醇（PtdIns）信号通路。
     

主要结果
1. 耐冷品种的转录组特征：CRQ64的DEGs和DAS事件数量均显著多于CSQ5，表明其通过更广泛的转录调控响应冷胁迫。
2. ROS平衡机制：CRQ64特异性DEGs显著富集于谷胱甘肽代谢和类黄酮合成通路（如查尔酮合成酶基因表达量提高3倍），暗示ROS清除能力增强是其耐冷关键。
3. 可变剪接的功能影响：DAS基因中仅19.5%同时发生表达变化，说明AS与转录调控独立作用。例如，热激蛋白*AUR62007509*的IR事件导致截短蛋白，可能影响其分子伴侣功能。

结论与价值
本研究首次通过ONT技术解析了藜麦冷胁迫下的全长转录组，揭示了耐冷品种CRQ64通过协同调控DEGs和AS事件维持ROS稳态的分子机制。科学价值体现在：
1. 基因组注释完善：新增6432个基因和55,389个异构体，为藜麦功能基因组研究提供资源。
2. 应用潜力：鉴定的关键基因（如CBFs、过氧化物酶基因）可作为分子标记用于耐冷作物育种。

研究亮点
1. 技术创新：结合ONT长读长测序与生物信息学分析（如TAPIS软件鉴定APA位点），首次在藜麦中系统解析AS事件。
2. 理论突破：提出“AS与转录调控协同但独立调控冷响应”的新观点，挑战了传统认为AS次要于表达调控的认知。

其他发现
- APA调控：冷胁迫下CRQ64的APA位点数量增加，且富集于“SRAG” motif（占34.3%），提示APA可能参与冷响应。
- 跨物种保守性：藜麦CBFs与拟南芥同源基因的调控机制相似，但新增了物种特异性靶基因（如脂代谢相关基因）。

（全文约2000字）