学术研究报告：基于随机基因组缩减技术提升大肠杆菌PHB合成效率的研究
作者与发表信息
本研究的通讯作者为山东大学微生物技术国家重点实验室的XueMei Lu和QingSheng Qi，第一作者为Shuai Ma。研究论文题为《Random genome reduction coupled with polyhydroxybutyrate biosynthesis to facilitate its accumulation in Escherichia coli》，于2022年8月发表在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》期刊（DOI: 10.3389/fbioe.2022.978211）。
学术背景
合成生物学领域长期致力于构建高效微生物底盘细胞，以优化高附加值产物的合成。基因组缩减（genome reduction）是一种重要策略，通过删除冗余基因（如转座子、应激响应基因等）减少细胞代谢负担并提升目标产物产量。然而，传统的理性设计方法（rational design）因基因组功能复杂性及基因间互作的不可预测性，常导致表型不稳定或生长受限。
本研究采用课题组前期开发的“转座子介导随机删除技术（Transposon-Mediated Random Deletion, TM RD）”，以聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）为模型产物，探索随机基因组缩减能否提升大肠杆菌的PHB合成能力。PHB是一种可降解生物塑料前体，其合成依赖乙酰辅酶A途径（由phbA、phbB、phbC基因编码的酶催化）。研究目标包括：（1）验证TM RD在定向优化生产底盘中的可行性；（2）阐明基因组缩减对PHB积累及生理特性的影响。
研究流程与方法
1. TM RD技术与PHB合成的耦合设计
- 实验对象：前期已通过5轮基因组缩减的大肠杆菌MG1655突变体库（R5）。
- 关键质粒构建：将PHB合成基因簇（phbCAB）克隆至中拷贝质粒p15a-phb（含lac启动子），并通过电转化导入R5库。
- 随机删除循环：
- 每轮10天，利用转座子Tn5随机插入基因组，随后通过CRISPR/Cas9诱导双链断裂（DSB），依赖细胞内源性的非同源末端连接（NHEJ）机制随机删除片段。
- 筛选方法：通过尼罗红染色（Nile red assay）筛选PHB高积累菌落（显红色），共完成10轮缩减，从最后两轮中选出18个候选菌株。
突变体表征与分析
PHB发酵验证
主要结果与逻辑关联
1. 基因组删除模式：共13个删除片段被鉴定，其中8个（如d1–d8）在多个突变体中重复出现，可能与适应性筛选相关。例如，d1（82.2 kb）包含限制修饰系统基因，其删除显著提升了电转效率。
2. 表型改善机制：
- PHB增产：删除冗余基因可能减少了代谢分流，增加乙酰辅酶A流向PHB合成途径。
- 生长优势：部分删除片段（如d9）涉及应激响应基因，可能降低维持代谢负担。
3. 数据支持结论：全基因组测序验证了TM RD的随机性，而生理实验证明删除组合的协同效应。
研究结论与价值
1. 科学意义：
- TM RD技术首次与产物合成耦合，证明随机删除可通过生长偶联筛选获得优化底盘。
- 揭示了非必需基因删除对代谢通量再分配的潜在影响。
2. 应用价值：为构建高效微生物细胞工厂提供了新策略，尤其适用于复杂产物合成途径的优化。
研究亮点
1. 方法创新：TM RD实现了连续、随机的基因组缩减，效率媲美理性设计（每轮删除约25 kb）。
2. 多维度验证：结合基因组学、生理学及发酵数据，系统性评估了突变体性能。
3. 可扩展性：该策略可适配其他产物合成途径（如抗生素或次级代谢物）。
其他发现
- 突变体H16的乙酸副产物产量（17.79 g/L）低于野生型（18.41 g/L），暗示基因组缩减可能优化了碳代谢平衡。
- 研究开源了测序数据（NCBI登录号未注明），支持后续分析。
（注：文中专业术语如“CRISPR/Cas9”、“NHEJ”等保留英文缩写，中文首次出现时标注全称。）