该文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是针对该研究的学术报告：

作者及机构

本文的主要作者为Y. H. Cui, P. Wei, P. Peng, M. H. Zong和W. Y. Lou，他们分别来自以下机构：
1. 华南理工大学（South China University of Technology）食品科学与工程学院应用生物催化实验室；
2. 广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室（Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety）；
3. 华南理工大学化学与化工学院（School of Chemistry and Chemical Engineering）。
该研究于2018年3月9日发表在期刊RSC Advances上，文章标题为《Efficient biocatalytic stereoselective reduction of methyl acetoacetate catalyzed by whole cells of engineered E. coli》。

学术背景

该研究属于生物催化与合成生物学领域，重点关注不对称生物还原反应在制备手性β-羟基酯（chiral β-hydroxy esters）中的应用。手性β-羟基酯是许多功能性材料（如药物、农用化学品、香料等）的关键构建模块。例如，甲基-®-3-羟基丁酸酯（®-HBME）是抗阿尔茨海默病药物、抗骨质疏松药物及可生物降解植入材料的潜在成分。

传统化学合成手性β-羟基酯存在反应条件苛刻（需高压、高温）、使用有毒试剂或贵金属催化剂等问题，而生物催化因其反应条件温和（常温常压）、环境友好等特点成为更优选择。然而，现有生物催化方法仍面临底物浓度低、产物收率不足、对映选择性（enantioselectivity）不稳定等挑战。本文旨在通过构建一种工程化大肠杆菌（engineered E. coli），优化其催化性能，实现高浓度甲基乙酰乙酸酯（methyl acetoacetate, MAA）的高效、高选择性还原。

研究流程

1. 工程菌构建

研究团队此前已构建了一株工程化大肠杆菌，该菌株同时表达以下两种酶：
- ACCR（羰基还原酶，carbonyl reductase）：来源于Acetobacter sp. CCTCC M209061，负责催化MAA的还原反应；
- GDH（葡萄糖脱氢酶，glucose dehydrogenase）：来源于Bacillus subtilis 168，用于原位再生辅酶NADPH。

2. 反应条件优化

研究通过多变量实验系统评估了以下关键参数对反应的影响：
- pH值（4.0–8.0）：最优pH为7.0，此时初始反应速率和产物收率最高（>99%），且对映选择性（e.e.）始终>99.9%。
- 温度（20–45°C）：40°C时反应速率最高（0.181 mol/L·h），但超过40°C后酶活性下降。
- 细胞投加量（20–100 mg/mL）：60 mg/mL时收率达96%，进一步增加用量仅缩短反应时间（4.5 h vs. 24 h）。
- 葡萄糖浓度（0–1500 mM）：200–1000 mM时辅酶再生效率最佳，过高浓度（>1000 mM）会因葡萄糖酸积累抑制细胞活性。

3. 底物与产物耐受性测试

• 底物抑制：MAA浓度升至350 mM时，初始反应速率达峰值（0.617 mol/L·h），收率85.3%；浓度超过400 mM时收率显著下降。
  
• 产物毒性：外源添加®-HBME（0–500 mM）对细胞活性和反应速率无显著影响，表明产物无毒性。
  

4. pH调控策略开发

研究发现反应中葡萄糖酸积累导致pH下降（至3.7），抑制酶活性。为此，团队提出分批补料（fed-batch）调控pH的方法：
- 单一碱调节：使用Na₂CO₃或组氨酸（His）时，收率分别达88%和89.4%；
- 复合调节（His-Na₂CO₃）：在1000 mM MAA条件下，收率提升至74.7%（8 h）和88%（24 h）。

5. 放大实验

在150 mL规模中，反应收率保持85%，对映选择性>99.9%，证明了该工艺的工业化潜力。

主要结果

1. 高对映选择性：在所有优化条件下，®-HBME的e.e.值均>99.9%。
   
2. 高底物耐受性：工程菌可耐受350 mM MAA，远高于文献报道的40–100 mM。
   
3. 高效辅酶再生：GDH系统实现了NADPH的持续再生，避免了昂贵辅酶的额外添加。
   
4. pH调控创新：通过His-Na₂CO₃复合调节解决了葡萄糖酸积累导致的pH下降问题。
   

结论与意义

该研究成功开发了一种基于工程大肠杆菌的全细胞生物催化体系，实现了MAA的高效、高选择性还原，其科学价值和应用价值包括：
1. 科学价值：
- 揭示了工程菌在高底物浓度下的催化性能与限制因素；
- 提出了pH动态调控的新策略。
2. 应用价值：
- 为手性β-羟基酯的工业化生产提供了可行方案；
- 空间-时间产率（265 g/L·d）达行业领先水平。

研究亮点

1. 菌株设计：双酶共表达系统（ACCR+GDH）实现了高效辅酶再生。
   
2. 工艺创新：通过pH调控解决了副产物抑制问题。
   
3. 规模化验证：150 mL规模的成功验证了工艺的可放大性。
   

其他价值

该研究还对比了野生菌株（Acetobacter sp. CCTCC M209061）与工程菌的性能，证明后者在反应速率（4.5 h vs. 24 h）和收率（96% vs. 89.3%）上的显著优势，为类似生物催化体系的优化提供了参考模板。