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CRISPR-Cas9介导的域特异性碱基编辑筛选技术实现水稻ACC酶变体的功能评估

作者及机构
本研究由Xiaoshuang Liu（安徽农业大学农学院）、Ruiying Qin（安徽省农业科学院水稻研究所）等共同完成，通讯作者为Pengcheng Wei（安徽省农业科学院水稻研究所）和Dexiang Wu（安徽农业大学农学院）。论文于2020年1月15日发表于《Plant Biotechnology Journal》（Volume 18, Pages 1845–1847）。

学术背景
本研究聚焦植物分子育种领域，旨在解决传统突变育种技术（如自然突变或理化诱变）存在的随机性和方向性缺失问题。乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase, ACCase）是脂肪酸生物合成的关键限速酶，其羧基转移酶（Carboxyltransferase, CT）结构域是除草剂（如芳氧苯氧丙酸酯类，APP）的主要作用靶点。尽管杂草中已发现ACC酶CT域的抗除草剂突变位点，但水稻（OsACC）中决定除草剂抗性的关键氨基酸尚未明确。研究团队通过开发基于CRISPR-Cas9的碱基编辑（Base Editing, BE）筛选平台，定向诱导OsACC CT域的定点突变，以期鉴定新型抗除草剂等位基因。

实验流程
1. sgRNA文库设计与构建
- 针对OsACC CT域的1653 bp编码序列，设计141条sgRNA，覆盖611 nt（EABE库）、788 nt（EBE3库）和393 nt（eCDA库）的可编辑窗口。
- 采用改良型碱基编辑器：增强型腺嘌呤碱基编辑器（EABE，实现A·T→G·C转换）、EBE3和eCDA（实现C·G→T·A转换）。其中EABE通过融合三重核定位信号（Nuclear Localization Sequence, NLS）优化编辑效率。
- 通过PhUc411载体构建sgRNA质粒库，转化大肠杆菌和农杆菌EHA105菌株。质粒库质量评估显示：sgRNA携带准确率>93.8%，64种独特sgRNA分布均匀（单sgRNA重复≤2次）。

1. 水稻遗传转化与抗性筛选

   • 将三种碱基编辑文库转入水稻品种“Feigeng2020”，约5000个潮霉素抗性愈伤组织/文库在含除草剂（Haloxyfop-R-methyl，1–2 μM）的再生培养基中筛选。
     
   • 对照组生长完全抑制，而EABE库中筛选出15株抗性植株和10个抗性愈伤组织；EBE3库获得2株抗性植株和1个愈伤组织；eCDA库无阳性结果。
     

2. 突变位点鉴定与功能验证

   • 基因分型发现：
     
     • 抗性事件中23/25携带sgRNA-127，导致T7→C单等位或双等位突变（对应C2186R氨基酸替换）。
       
     • 1例携带sgRNA-128（T13→C，同样产生C2186R突变）。
       
     • 1例携带sgRNA-10（A16→G，导致I1879V突变）。
       
     • EBE3库中3例抗性事件均含sgRNA-121（G1→C，导致W2125S突变）。
       
   • 温室表型验证：喷洒商用除草剂Gallant后，野生型植株7天内死亡，而I1879V纯合和C2186R杂合突变体均表现出显著抗性。
     

主要结果
1. 新型抗性位点发现
- 首次在水稻中鉴定出W2125S突变（不同于杂草中保守的W2125C突变），扩展了ACC酶抗性等位基因库。
- I1879V突变（对应杂草I1781V）对水稻农艺性状无负面影响（株高、剑叶长度和结实率与野生型无显著差异），具备育种应用潜力。

1. 基因型-表型关联分析

   • C2186R纯合突变导致胚胎致死，杂合体表现生长迟育和完全不育，表明该突变存在适应性代价。
     
   • 抗性突变位点均位于CT域与除草剂直接互作的区域，印证了ACC酶靶向修饰的合理性。
     

2. 技术方法创新

   • 通过优化BE系统（如EABE的NLS三重融合）和非典型编辑窗口（如sgRNA-10靶向第16位碱基），成功实现非标准位点的有效编辑，拓展了碱基编辑的应用范围。
     

结论与价值
1. 科学意义
- 建立了首个针对水稻ACC酶CT域的碱基编辑筛选平台，为植物蛋白质定向进化提供了范例。
- 揭示了OsACC抗性突变与生长发育的权衡关系，为靶标基因功能研究提供了新思路。

1. 应用前景
   
   • I1879V突变可作为抗除草剂水稻育成的理想靶点，其低适应性成本适合商业化品种开发。
     
   • 研究策略可推广至其他作物重要性状相关基因的高通量功能解析。
     

研究亮点
1. 首次将域特异性碱基编辑筛选技术应用于水稻ACC酶功能研究，实现从基因型到表型的系统性关联分析。
2. 发现新型抗性等位基因W2125S，突破了杂草中保守突变位点的认知局限。
3. 改良的EABE系统（NLS三重融合）与非典型编辑事件的成功捕获，为碱基编辑器设计提供了技术参考。

其他发现
研究团队指出，当前BE系统的编辑窗口限制（如eCDA仅覆盖393 nt）和转换类型单一（如缺乏G·C→C·G工具）是筛选效率的主要制约因素。未来通过开发广PAM识别、宽编辑窗口的多功能碱基编辑器，可进一步提升定向进化效率。