基于CRISPR-HDR几何匹配策略提升丝状真菌基因组编辑效率的研究报告
第一， 研究团队与发表信息 本研究由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室、生物工程学院的付明星、王静、李静怡、周尧、黄晓飞、贾泽涵、罗一清、谭新宇、高岩、于冰姿、段雨婷、卜倩云、李晓颖、王一凡，日本筑波大学可持续性微生物学研究中心的Naoki Takaya，以及华东理工大学和北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室的周圣民教授（通讯作者）共同完成。研究成果以“Dual-single-guide RNA strategy improves CRISPR-mediated homology-directed repair in Aspergillus”为题，发表于2026年的《核酸研究》（*Nucleic Acids Research*）期刊第54卷。
第二， 学术背景与研究目的 本研究属于合成生物学与生物工程领域，聚焦于CRISPR-Cas9系统介导的同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）技术在丝状真菌中的效率优化问题。CRISPR-Cas9已成为真核生物中进行精确基因组编辑的主流技术，其通过向导RNA（sgRNA）引导Cas9在特定位点产生DNA双链断裂（Double-Strand Break, DSB），进而利用细胞自身的HDR途径，以提供的外源供体DNA（donor DNA）为模板，实现目标基因的敲入、标签融合或点突变等精确编辑。
然而，HDR的成功率常受到多种因素限制。本研究团队关注到一个关键的结构性瓶颈：在常规的单sgRNA（single-sgrna）切割策略中，Cas9的切割位点往往因PAM序列等限制，无法与计划插入供体DNA的位点完全重合。这种“切割位点”与“插入位点”的空间错位，可能导致供体DNA与由重组酶Rad51（在构巢曲霉中为其同源物UvsC）介导的“链入侵（strand invasion）”起点在几何上不匹配。这种不匹配可能引发两种主要的修复失败路径：1）过早退火（Premature Annealing）：当插入序列位于Rad51加载链的对侧时，入侵的3‘单链DNA（3’ ssDNA）可能在到达供体的上游同源臂（Homology Arm, HA）之前，就提前与基因组序列退火，导致供体插入失败，仅引入同义突变以逃避Cas9的再次切割（即“PAM逃逸”基因型）。2）不支持性3‘末端（Unsupported 3′ Ends）或长未配对3‘瓣（Long Unpaired 3′ Flap）：当插入序列位于Rad51加载链的同侧但距离切割点较远时，入侵的3‘末端在遇到供体插入序列时，会形成一个未配对的单链“瓣”。如果此“瓣”过长，会阻碍DNA聚合酶的加载和延伸，导致链入侵流产，修复转向易出错的非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）途径。
尽管已有研究尝试通过同义密码子重编码（synonymous recoding）来减少过早退火，但该方法存在局限性：仅适用于插入位点位于Rad51加载链上游的情况，且无法应用于保守区域（如剪接位点、蛋白编码域），对于长片段插入或距离切割点较远的编辑效果不佳。因此，本研究旨在阐明链入侵方向性对HDR效率的制约机制，并开发一种能克服此结构性限制的通用策略，以实现高效、精确的基因组编辑，特别是在结构受限的位点（如C端标签、双向启动子、远距离双位点突变）。
第三， 详细研究流程与方法 本研究以模式丝状真菌构巢曲霉（*Aspergillus nidulans*）为主要研究对象，并拓展至米曲霉（*Aspergillus oryzae*）和烟曲霉（*Aspergillus fumigatus*）。研究流程系统性地从机制探索到策略开发与应用验证，可分为以下几个核心步骤：
1. 机制探究：Rad51同源物UvsC在Cas9诱导DSB处的方向性加载 * 研究对象与处理：选择构巢曲霉的色素基因 wa 作为模型位点。在 wa 基因编码区+220位置设计单个sgRNA，引导Cas9产生DSB。构建了C端带有FLAG标签的UvsC（UvsC-FLAG）菌株。 * 实验方法：在Cas9/sgRNA质粒和供体DNA共转化后2小时和4小时，对转化原生质体进行染色质免疫共沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）分析。在切割位点两侧（PAM近端与PAM远端）对称设计多对引物，检测UvsC-FLAG在DSB两侧3‘ ssDNA区域的富集情况。 * 数据分析流程：通过qPCR检测ChIP产物中两侧DNA片段的含量，将信号较弱的侧标准化为1，另一侧表示为相对富集倍数，以此量化UvsC加载的方向性偏好。此方法可可靠地检测断裂点约250 bp范围内的蛋白-DNA相互作用。
2. 验证方向性加载对HDR效率的影响 * 供体设计与实验分组：在 wa 基因+220切割位点，设计了一系列供体DNA。变量包括：插入片段长度（100 bp 或 1 kb）、插入位置相对于切割点的方向（PAM远端侧 或 PAM近端侧）、插入位点与切割点的距离（20, 50, 100 bp）。所有供体两侧均带有1 kb的同源臂，并引入同义突变破坏供体上的PAM序列以防被Cas9重新切割。 * 转化与效率评估：将Cas9/sgRNA质粒与不同设计的供体DNA共同转化构巢曲霉原生质体。在选择性培养基上筛选转化子，随机挑取克隆进行菌落PCR和测序验证。阳性克隆率定义为产生正确PCR产物且测序验证成功的转化子占筛选总数的百分比。 * 特殊表型分析：观察并测序分析转化平板上出现的“黄色菌落”（代表供体模板修复了PAM位点但未插入目标片段），以验证“过早退火”机制。
3. 开发并验证双sgRNA策略 * 策略设计：在目标插入位点的两侧分别设计一个sgRNA，引导Cas9产生两个DSB，从而精确切除一段染色体片段，形成一个“DSB窗口”。供体DNA的设计使其两个同源臂恰好与这个窗口的上下游边界对齐，插入片段则填充于窗口中央。 * 在 wa 基因的概念验证：在 wa 基因的+65和+220位置设计双sgRNA，创建DSB窗口。评估了100 bp和1 kb dsDNA供体在此策略下的整合效率。同时，设计了“错配”供体（供体同源臂延伸超出DSB边界>50 bp）作为对照，以验证几何对齐的重要性。此外，还比较了单链寡核苷酸（ssODN）供体在单切与双切策略下的编辑效率。 * UvsC加载方向性在双切条件下的检测：使用ChIP-qPCR检测双DSB系统中两个切割点附近UvsC的加载情况，以了解复杂断裂结构下的重组酶行为。
4. 双sgRNA策略在复杂编辑任务中的应用验证 * C端标签无缝插入： * 靶基因：硫氧还蛋白基因 trxA 和氧化应激转录因子基因 *napa*。 * 双切设计：分别在 trxA 终止密码子上游-170 bp和下游+147 bp，以及在 napa 终止密码子上游-260 bp和下游+58 bp设计切割位点。 * 供体：携带FLAG或GFP标签的dsDNA供体，标签精确插入终止密码子前，保留天然终止子。 * 对照：使用单切策略，在终止密码子下游切割，并使用携带外源强终止子 t_trpc 的供体，构建 trxA-FLAG-t_trpc 和 napa-GFP-t_trpc 菌株。 * 功能验证：通过表型分析（H₂O₂胁迫生长）、RT-qPCR、Western Blot、荧光显微镜观察以及全基因组测序（评估脱靶效应和基因组稳定性），比较双切策略与单切策略在蛋白表达、功能及基因组安全性上的差异。 * 双向启动子工程： * 靶系统：共享双向启动子的硝酸盐还原酶（*niad*）和亚硝酸盐还原酶（*niia*）基因对。 * 编辑目标：在 niad 起始密码子附近（-66 bp和+21 bp）进行双切，用包含天然 niad 启动子（*p_niad*）和组成型强启动子 p_gpda 的供体进行替换，构建 *pp-niia*（保留完整 niia 面向的 *p_niad*）菌株。 * 对照：单切策略在-66 bp处切割，使用类似供体但导致 niia 面向的启动子被截短，构建 tpp-niia 菌株。 * 功能验证：通过在不同氮源上的生长实验和RT-qPCR，评估对 niad 和 niia 表达的影响。 * 长距离双位点突变： * 靶基因：过氧化物还原酶基因 prxA 的两个关键半胱氨酸残基（Cys31和Cys61）。 * 双切设计：在+130 bp和+266 bp（分别靠近两个突变位点）处设计双sgRNA，创建一个136 bp的编辑窗口。 * 供体：使用携带C31S和C61S双突变的dsDNA供体（两侧1 kb同源臂）。 * 对照：1）使用单切（+130 bp处）结合ssODN供体（30 nt同源臂）；2）使用单切（+130 bp处）结合dsDNA供体。 * 验证：通过测序分析突变效率，并通过H₂O₂敏感性实验验证蛋白功能丧失。
5. 跨物种验证 * 研究对象：米曲霉的 wa 基因和烟曲霉的 abl1 基因。 * 方法：分别在两个基因的编码区设计单切和双切sgRNA，使用100 bp和1 kb的dsDNA供体进行插入实验。 * 评估：比较单切与双切策略在不同物种、不同长度插入片段下的阳性克隆率。
第四， 主要研究结果 1. UvsC在Cas9诱导的DSB处存在方向性加载，且此方向影响HDR效率。 ChIP-qPCR结果显示，在 wa +220单一切割位点，UvsC在PAM远端侧的富集显著高于PAM近端侧（4小时后约高8倍），表明其加载具有方向偏好性。这种偏好性在不同切割位点普遍存在，但偏向程度各异，提示其可能受局部序列或染色质环境影响，而非由Cas9结合方向决定。 HDR效率实验证实了这种方向性的功能重要性：当插入片段位于UvsC加载偏向的PAM远端侧时，整合效率随插入位点与切割点距离的增加而急剧下降（100 bp插入：20 bp处~50%，50 bp处~20%，100 bp处为0）。当插入片段位于对侧（PAM近端侧）时，即使在20 bp的短距离下效率尚可，但距离增至50 bp及以上时效率降至0。更重要的是，在PAM近端侧插入的实验中，观察到了“黄色菌落”，测序证实其为“PAM逃逸”但未插入的基因型，这为“过早退火”机制提供了直接证据。这些结果清晰地表明，供体插入位点与链入侵起点（由UvsC加载方向定义）的空间错位是导致HDR失败的关键结构瓶颈。
2. 双sgRNA策略通过创建几何匹配的链入侵窗口，显著提升HDR效率。 在双DSB条件下，ChIP-qPCR显示UvsC在两个切割点的加载模式可能与单一切割时不同，强调了局部结构环境的影响。 关键的应用结果显示，双切策略极大地改善了编辑效率： * 在 wa 基因中，对于100 bp和1 kb插入，双切策略将效率分别提升至80%和60%，而单切策略在相应条件下效率极低或为0。 * 故意设计的“错配”供体（几何不对齐）导致效率骤降至10%以下，反向证明了几何对齐的核心重要性。 * 即使对于通常依赖Rad52途径的ssODN供体，双切策略也将其编辑效率从单切下的20-30%提升至60%，表明精确的末端对齐对退火过程同样有益。
3. 双sgRNA策略在多种复杂编辑场景中展现出优越性。 * C端标签插入：双切策略成功实现了 trxA-FLAG 和 napa-GFP 的无缝融合（效率分别达50%和成功获得），保留了天然终止子。功能分析表明，这些菌株的蛋白表达水平、氧化应激反应和亚细胞定位与野生型类似。而使用单切加外源终止子（*t_trpc*）的对照菌株（trxA-FLAG-t_trpc, *napa-GFP-t_trpc*）出现了表达失调（异常高表达）、应激反应受损等问题。全基因组测序证实，双切策略并未增加脱靶风险或引起基因组结构性变异，安全性良好。 * 双向启动子工程：双切策略成功将强启动子 p_gpda 插入 niad 起始密码子前，构建的 pp-niia 菌株实现了 niad 的组成型高表达，同时完全保留了 niia 的天然启动子完整性和硝酸盐诱导性。而单切策略构建的 tpp-niia 菌株则部分破坏了 niia 的启动子，导致其表达量大幅下降且诱导性丧失。这凸显了双切策略在精细调控元件编辑中的结构精确性优势。 * 长距离双位点突变：双切策略结合dsDNA供体，实现了 prxa 基因C31S和C61S双突变的100%协同替换。而单切策略结合ssODN供体只能有效引入近切割点的C31S突变（效率30%），对92 bp外的C61S突变完全无效；单切结合dsDNA供体的效率也远低于双切。这证明双切策略能有效克服“退火优先效应”，实现大跨度序列的精确替换。
4. 双sgRNA策略具有跨物种普适性。 在米曲霉和烟曲霉中的验证实验表明，双切策略能显著提升不同长度片段（100 bp, 1 kb）的整合效率。例如，在米曲霉 wa 基因中，对于1 kb插入，单切效率为0，而双切提升至60%。这证明了该策略在丝状真菌中具有广泛的应用潜力。
第五， 研究结论与价值 本研究得出核心结论：CRISPR-HDR的效率受到供体DNA几何结构与内源性链入侵路径之间空间匹配度的根本性制约。 基于对Rad51（UvsC）方向性加载机制的洞察，本研究创新性地提出了 “双sgRNA结构对接”策略。该策略通过在插入位点两侧引入精确的Cas9切割，创造出一个与供体DNA完美匹配的“链入侵窗口”，从而解决了因切割点与插入点错位导致的“过早退火”和“未配对3‘瓣”问题。
科学价值： 1. 揭示了HDR效率的一个关键结构决定因素：明确了链入侵方向性与供体对齐的几何兼容性是影响精确基因组编辑成败的深层机制，超越了以往主要关注修复通路平衡（如抑制NHEJ）或生化增强（如过表达Rad51）的研究视角。 2. 提出了一个通用的“结构-对接”模型：为理解并优化HDR过程提供了一个清晰的几何框架和设计原则，即通过双切使供体两端与染色体DNA合成方向同时对齐，实现空间协同。 3. 提供了强大的方法论工具：开发的双sgRNA策略是一种不依赖于序列修改（如同义重编码）、不引入外源调控元件（如外源终止子）的普适性方案，特别适用于结构受限位点、长片段插入和多位点协同编辑。
应用价值： 1. 大幅提升编辑效率与可靠性：尤其在长片段插入和复杂编辑任务中，能获得更高且更稳定的阳性率。 2. 保障编辑的“原汁原味”：通过无缝整合，最大程度保留靶基因的天然调控序列（如启动子、终止子、UTR），确保编辑后蛋白的表达水平和功能更接近野生型，这对于功能研究和工业菌株理性改造至关重要。 3. 拓展编辑能力边界：使得双向启动子改写、远距离多位点精确突变等以往难以高效完成的任务成为可能。 4. 跨物种适用性：在多种重要丝状真菌中验证有效，为真菌遗传学、合成生物学和生物制造领域提供了强有力的通用基因组编辑平台。
第六， 研究亮点 1. 机制驱动的策略创新：研究并非简单的技术尝试，而是从探究Rad51加载方向性这一基础机制入手，发现问题根源，并据此设计出具有坚实理论依据的解决方案。 2. 系统性验证：从机制验证（ChIP-qPCR）、原理验证（wa 基因模型），到多场景应用验证（C端标签、启动子工程、双位点突变），再到跨物种验证，构成了完整、严谨的证据链。 3. 解决实际痛点：精准针对了当前真菌基因组编辑中C端标签融合常需破坏天然终止子、长片段和复杂编辑效率低等实际难题，提供了有效的解决方案。 4. 策略的普适性与优雅性：双sgRNA策略概念清晰，设计逻辑直接，不依赖复杂的额外元件或操作，易于在其他系统和实验室推广实施。
第七， 其他有价值内容 研究在讨论部分对比了其“结构-对接”模型与已知的“切割至突变距离效应”，将后者纳入更广义的几何匹配框架中加以解释。同时，研究也坦诚指出了尚未完全阐明的机制问题，如Rad51加载方向性的精确决定因素、链入侵与D环形成的实时可视化挑战等，为未来研究指明了方向。此外，研究通过全基因组测序评估了双切策略的基因组安全性，为其实用化提供了重要的安全性数据支撑。