这篇由大连海洋大学水产与生命学院的李佳明、马宇涵、杨志超、王凤池、李佳霖、蒋雨升、杨大佐、衣启麟和黄树等人合作完成的题为《Foxo-like gene is involved in the regulation of 20E pathway through mTOR in *Eriocheir sinensis*》的研究论文，发表于《Journal of Marine Science and Engineering》期刊的2023年6月14日刊。该研究属于甲壳动物分子生物学与内分泌学交叉领域，是一项关于特定基因在中华绒螯蟹蜕皮过程中调控机制的原创性研究。
学术背景与研究目的 蜕皮是甲壳动物生长、发育和变态的关键生理过程，这一过程主要由两种相互拮抗的激素协同调控：20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone, 20E）促进蜕皮，而蜕皮抑制激素（molt-inhibiting hormone, MIH）抑制蜕皮。20E通过与蜕皮激素受体（Ecdysone receptor, EcR）和类视黄醇X受体（Retinoid X receptor, RXR）形成的异源二聚体复合物结合来传递信号。近年来研究发现，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）通路在节肢动物蜕皮激素的合成中也扮演着重要角色。另一方面，叉头框O（Forkhead box O, FoxO）转录因子家族是胰岛素信号通路的关键下游分子，在调节生长、代谢、免疫和寿命等多种生理过程中发挥核心作用。在昆虫中的研究表明，FoxO参与了生长发育和蜕皮变态的调控，例如20E可以激活FoxO来促进蛋白质水解以支持蜕皮。然而，在甲壳动物中，关于FoxO的研究主要集中在免疫应答方面，其在蜕皮过程中的作用尚属未知。
基于以上背景，本研究旨在探究中华绒螯蟹中的FoxO样基因（命名为EsFoxO-like）是否以及如何参与调控蜕皮过程。具体目标包括：（1）鉴定并表征中华绒螯蟹的EsFoxO-like基因；（2）分析该基因在不同组织及不同蜕皮阶段的表达模式；（3）研究抑制EsFoxO-like功能对20E浓度、蜕皮相关基因（EsEcR, EsRXR, EsMIH）表达的影响；（4）探究EsFoxO-like是否通过mTOR通路来调控20E信号途径。
详细研究流程 本研究设计严谨，流程环环相扣，主要包括以下几个部分：
1. 基因鉴定与序列分析： 研究团队首先从NCBI数据库获取中华绒螯蟹基因组数据，通过序列比对和结构域分析，筛选并鉴定出一个FoxO样基因（EsFoxO-like）。随后，根据该基因序列设计特异性引物，以中华绒螯蟹肝胰腺cDNA为模板进行PCR扩增，克隆获得了852 bp的开放阅读框（ORF）序列，该序列编码一个由283个氨基酸组成的蛋白质。通过生物信息学工具（如SMART、NetPhos-3.1、Clustal X、MEGA 11.0）对EsFoxO-like的蛋白结构域、磷酸化位点、同源性及系统进化关系进行了全面分析。
2. 实验蟹的准备与样品采集： 实验所用中华绒螯蟹（约10克重）购自江苏连云港。研究分为多个部分，涉及不同样品： * 组织分布分析： 选取9只蟹，分别采集血细胞、心脏、肝胰腺、胃、肌肉、鳃和眼柄组织，用于分析EsFoxO-like mRNA的组织表达谱。 * 蜕皮阶段表达分析： 在蜕皮后（post-molt）、蜕皮间（inter-molt）和蜕皮前（pre-molt）三个阶段，每个阶段各取3只蟹，采集其肝胰腺组织，用于检测EsFoxO-like mRNA和蛋白水平的表达变化。肝胰腺被选为重点研究对象，因其是重要的代谢和免疫器官，并参与蜕皮过程。 * 功能实验样品： 用于后续抑制剂和RNA干扰实验的蟹均处于蜕皮间期，以确保生理状态一致。处理后收集肝胰腺（检测EsFoxO-like, EsEcR, EsRXR, EsmTOR mRNA及EsFoxO-like蛋白）、眼柄（检测EsMIH mRNA）和血清（检测20E浓度）。
3. EsFoxO-like在蜕皮阶段的表达模式分析： 使用实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测肝胰腺在三个蜕皮阶段EsFoxO-like的mRNA表达量。同时，使用商业化的FoxO1抗体（ab52857, Abcam）通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测EsFoxO-like蛋白的表达水平。这是首次在中华绒螯蟹中同时从转录和翻译水平验证FoxO样基因的蜕皮周期表达谱。
4. 通过抑制剂（AS1842856）抑制EsFoxO-like功能： 为了探究EsFoxO-like的功能，研究使用了一种特异性的FoxO1抑制剂AS1842856。将18只蜕皮间期蟹随机分为两组：实验组注射AS1842856（溶于DMSO，终浓度1 µg/µl），对照组注射等量DMSO溶剂。注射24小时后，采集样品。通过qRT-PCR和Western blotting验证抑制效果，并检测20E浓度（使用蟹蜕皮激素ELISA试剂盒）以及EsEcR、EsRXR、EsMIH和EsmTOR的mRNA表达水平。
5. 通过RNA干扰（RNAi）技术敲低EsFoxO-like表达： 为了进一步验证抑制剂实验的结果，并排除抑制剂可能存在的脱靶效应，研究采用了RNAi技术。设计并合成了针对EsFoxO-like基因的双链RNA（dsRNA），同时以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的dsRNA作为阴性对照。将27只蟹分为三组：PBS缓冲液组、EGFP-dsRNA组和EsFoxO-like-dsRNA组。注射24小时后，采集样品。通过qRT-PCR和Western blotting评估敲低效率，并检测与抑制剂实验相同的指标（20E浓度，EsEcR, EsRXR, EsMIH, EsmTOR mRNA）。
6. 探究mTOR在EsFoxO-like调控通路中的作用： 这是本研究的关键环节，旨在建立EsFoxO-like与mTOR之间的功能联系。首先，在上述抑制剂和RNAi实验中，已同步检测了EsmTOR mRNA的表达变化。其次，为了直接验证EsFoxO-like是否通过mTOR发挥作用，研究设计了“抑制剂叠加”实验：先用AS1842856抑制EsFoxO-like（持续24小时），然后在此基础上，再使用mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）处理。将18只蟹分为两组：AS1842856 + Rapamycin组和AS1842856 + DMSO组。在雷帕霉素处理12小时后，采集样品，检测EsmTOR mRNA表达以验证雷帕霉素的抑制效果，同时检测20E浓度、EsEcR、EsRXR和EsMIH的表达，观察在mTOR被抑制后，由EsFoxO-like抑制所引起的效应是否发生逆转。
7. 数据分析： 所有数据均以均值±标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验和Levene‘s检验分别评估数据的正态分布和方差齐性。对于符合正态分布的数据，采用Student’s t检验（两组比较）或单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验（多组比较）。对于非正态分布数据，采用Mann-Whitney U检验。显著性水平设定为P < 0.05。
主要研究结果 1. EsFoxO-like基因的特征与表达谱： 成功克隆了EsFoxO-like基因，其编码的蛋白含有一个保守的叉头（Forkhead， FH）结构域（位于140-208氨基酸之间），并具有蛋白激酶A和糖原合成酶激酶3的潜在磷酸化位点。系统进化树分析显示，EsFoxO-like与对虾、梭子蟹等其他甲壳动物的FoxO聚为一支，表明其属于无脊椎动物FoxO家族。组织分布显示，EsFoxO-like mRNA在肝胰腺中表达量最高，其次是眼柄、心脏等，在血细胞中最低。最重要的是，在蜕皮周期中，无论是mRNA还是蛋白水平，EsFoxO-like在蜕皮前期的肝胰腺中表达量均显著上调，达到最高峰，而在蜕皮后期表达量最低。
2. 抑制EsFoxO-like对20E通路的影响： 无论使用AS1842856抑制剂还是RNAi敲低技术，有效抑制EsFoxO-like后，均观察到以下一致且显著的变化： * 血清中20E浓度显著升高。 * 肝胰腺中20E受体基因EsEcR和EsRXR的mRNA表达水平显著上调。 * 眼柄中蜕皮抑制激素基因EsMIH的mRNA表达水平显著下调。 * 同时，肝胰腺中EsmTOR的mRNA表达水平显著上调。 这些结果首次证明，在中华绒螯蟹中，EsFoxO-like对20E信号通路具有负调控作用，即抑制EsFoxO-like会促进20E的合成/信号传导（表现为20E浓度升高、受体表达上调），并抑制MIH的表达。而且，这种调控可能与mTOR有关，因为抑制EsFoxO-like同时激活了mTOR的表达。
3. mTOR介导了EsFoxO-like的调控作用： “抑制剂叠加”实验的结果为EsFoxO-like通过mTOR发挥作用提供了关键证据： * 在AS1842856抑制EsFoxO-like的基础上，再使用雷帕霉素抑制mTOR活性，成功逆转了单独抑制EsFoxO-like所产生的大部分效应。 * 与AS1842856 + DMSO组相比，AS1842856 + Rapamycin组中，由EsFoxO-like抑制引起的20E浓度升高和EsMIH表达下调被显著逆转（均显著降低）。 * 有趣的是，EsEcR和EsRXR的表达在mTOR被抑制后反而进一步升高。论文作者推测，这可能与胰岛素/PI3K通路的代偿性激活有关，该通路已知能促进EcR和RXR的表达。 * 同时，EsmTOR本身的mRNA表达在雷帕霉素处理后也如预期般下降。 这一系列结果有力地支持了“EsFoxO-like通过mTOR调控20E通路”的假说。EsFoxO-like抑制后解除了对mTOR的抑制，活化的mTOR进而促进20E合成并抑制MIH表达；而当mTOR被雷帕霉素阻断后，即使EsFoxO-like被抑制，其下游促蜕皮效应也无法实现。
结论与意义 本研究得出明确结论：在中华绒螯蟹中，FoxO样转录因子（EsFoxO-like）通过mTOR信号通路负向调控20E信号途径，从而参与蜕皮过程的调控。具体机制是：EsFoxO-like可能通过抑制mTOR的活性，进而抑制20E的合成和其受体EcR/RXR的表达，同时可能解除对MIH表达的抑制（或存在其他间接途径），共同作用导致蜕皮被抑制。当EsFoxO-like活性降低时，其对mTOR的抑制作用解除，mTOR激活，最终促进20E通路并抑制MIH，推动蜕皮进程。
本研究的科学价值在于： * 拓展了认知： 首次在甲壳动物中揭示了FoxO转录因子在蜕皮调控中的关键作用，将FoxO的功能从已知的免疫调节拓展到了生长发育的核心过程。 * 阐明了机制： 首次在甲壳动物中构建了“FoxO —| mTOR —> 20E通路”的调控轴，为理解蜕皮的内分泌和分子调控网络增添了新的重要环节。 * 连接了通路： 将胰岛素/PI3K/Akt/FoxO这条经典的代谢与生长调控通路，与节肢动物特有的蜕皮激素合成通路（mTOR-20E）联系起来，为研究跨物种保守的生命过程调控提供了新视角。
其应用价值主要体现在为甲壳动物（尤其是中华绒螯蟹这种重要经济物种）的人工养殖和生长调控提供了潜在的理论依据和分子靶点。通过干预FoxO-mTOR-20E轴，或许能够开发出促进同步蜕皮、提高生长速度或改善成活率的新方法。
研究亮点 1. 研究对象的创新性： 首次系统研究FoxO在中华绒螯蟹蜕皮中的作用，填补了甲壳动物该研究领域的空白。 2. 研究策略的严谨性： 采用了“基因鉴定-表达谱分析-功能缺失（抑制剂+RNAi双验证）-机制探索（通路抑制剂叠加）”的完整逻辑链条，实验设计周密，证据相互印证，结论可靠。 3. 技术手段的综合性： 结合了分子克隆、生物信息学分析、qRT-PCR、Western blotting、ELISA、RNA干扰和药理学抑制剂等多种技术，从序列、转录、翻译和激素水平进行了多维度解析。 4. 机制阐释的深度： 不仅发现了现象（EsFoxO-like抑制促进蜕皮），还深入探究了其上游效应（激活mTOR）并利用雷帕霉素逆转实验初步验证了其作用途径，使机制阐释更具说服力。 5. 对复杂生理过程的洞察： 注意到了EcR/RXR在mTOR抑制后反常升高的现象，并给出了合理的科学推测，显示了研究者对相关信号网络复杂性的深刻理解。
其他有价值内容 论文在讨论部分，还对比了昆虫与甲壳动物中FoxO功能的异同，指出在昆虫如黑腹果蝇中，FoxO/USP复合物可能直接抑制20E合成，而在中华绒螯蟹中，EsFoxO-like可能主要通过mTOR间接调控。这种跨类群的比较有助于理解FoxO调控网络的进化。此外，研究也为进一步探索胰岛素/PI3K通路如何与FoxO-mTOR-20E轴交互作用以精细调控甲壳动物生长指明了方向。