该研究由印度海得拉巴细胞与分子生物学中心（Centre for Cellular and Molecular Biology）的S.G. Panicker和L. Singh团队完成，发表于1994年的期刊《Chromosoma》（Volume 103, Pages 40-45），标题为《Banded krait minor satellite (BKM) contains sex and species-specific repetitive DNA》。
学术背景
本研究属于分子遗传学和进化生物学领域，聚焦于爬行动物性别染色体的重复DNA（repetitive DNA）结构及其功能。研究背景基于以下关键发现：
1. 蛇类性别染色体特征：蛇类（ZZ/ZW系统）的W染色体富含散布重复序列，此前已从雌性带纹金环蛇（Bungarus fasciatus）基因组中分离出名为BKM（banded krait minor）的卫星DNA（satellite DNA），其主要成分为保守的四核苷酸重复序列GATA。
2. 跨物种保守性：BKM序列在真核生物中保守存在，且在哺乳动物（如小鼠和人类）的Y染色体中发现类似性别特异性重复序列，提示其在性别决定中的潜在作用。
3. 研究目标：探索BKM序列在W染色体上的组织架构，分离性别和物种特异性重复序列，并解析其功能意义。
研究流程
1. DNA提取与BKM卫星DNA分离
- 样本来源：从带纹金环蛇的肝脏、肾脏、脾脏和心脏提取高分子量DNA，采用改进的Marmur（1961）方法，包括酚-氯仿纯化和异丙醇沉淀。
- 卫星DNA富集：通过Cs₂SO₄梯度离心（Ag⁺/DNA比例为0.25）分离BKM卫星DNA，重复离心以提高纯度。
2. 克隆与排除杂交筛选
- 文库构建：用EcoRI酶切BKM DNA，克隆至pUC13载体，转化DH5α大肠杆菌，通过蓝白斑筛选重组菌落。
- 性别特异性克隆筛选：采用排除杂交法（exclusion hybridization），以8000倍过量雄性基因组DNA为竞争剂，筛选仅与雌性DNA杂交的克隆，最终获得8个阳性克隆（如br87、br145等）。
3. 分子特性分析
- Southern印迹杂交：用³²P标记的br87探针检测不同蛇种（蟒科Boidae、游蛇科Colubridae、眼镜蛇科Elapidae）及鸡的基因组DNA，确认br87仅与带纹金环蛇雌性DNA杂交，显示其物种和性别特异性。
- 染色体定位：通过原位杂交（in situ hybridization）将³H标记的br87定位到W染色体短臂，分析100余个中期分裂相，证实其特异性分布。
4. 序列分析与结构解析
- 测序：采用Sanger双脱氧链终止法对br87（206 bp）测序，发现其包含两类内部重复单元（18-19 bp）：
- Type I：核心序列为GGATTCCTCACACTTTAA，含GATA类似基序。
- Type II：富含G/T/A/C簇（如GGGGAGTTTTCAA）。
- 结构特征：两类重复单元交替排列，间隔1-3个核苷酸，无开放阅读框（ORF），AT含量56.3%。数据库比对显示最高同源性（58.3%）仅与鸡脂蛋白脂肪酶基因部分序列相似。
主要结果
- 性别与物种特异性：Southern杂交显示br87仅存在于带纹金环蛇雌性，其他蛇种和鸡无信号（图2）。
- 染色体定位：原位杂交证实br87集中于W染色体短臂（图3），与BKM（GATA）的全染色体分布形成对比。
- 序列独特性：br87的重复单元结构与鸟类W染色体特异性序列（如鸡XhoI家族）不同，提示爬行动物特异性进化路径。
结论与意义
- 科学价值：首次在爬行动物中发现W染色体特异性重复序列，揭示了性别染色体在物种分化中的快速进化特征。
- 功能假说：br87可能与W染色体的凝聚态维持相关，其与BKM（GATA）的共定位暗示协同调控染色质结构的可能性。
- 应用潜力：为研究性别决定机制和物种形成提供了分子标记，尤其在蛇类系统发育分析中具有工具价值。
研究亮点
- 方法创新：开发排除杂交法高效筛选性别特异性克隆，克服重复序列交叉杂交的干扰。
- 发现新颖性：br87是首个被报道的爬行动物W染色体专属重复序列，填补了该领域空白。
- 进化启示：通过比较不同物种性别染色体重复序列的差异，支持“性别决定区域独立进化”假说。
其他有价值内容
- 作者推测br87可能通过DNA结合蛋白（如识别GATA的蛋白）参与染色质动态调控，这与后续发现的鸟类W染色体结合蛋白（Harata et al., 1988）形成呼应。
- 研究暗示BKM相关序列的快速进化可能是物种间生殖隔离的分子基础，为理解 speciation（物种形成）提供了新视角。