本文发表于 *FEMS Yeast Research*（2014年，第14卷，第1068–1079页），由波兰热舒夫大学生物化学与细胞生物学系的 Magdalena Kwolek-Mirek 和 Renata Zadrag-Tecza 撰写。文章属于方法学比较研究，系统评估了多种用于检测酵母细胞活力（viability）与生命力（vitality）的方法，并比较了它们在氧化应激条件下的表现差异。
研究背景与目的
在毒理学和工业微生物学中，细胞活力的测定是评估化学、物理或环境因子影响的最常用手段之一。细胞活力通常定义为整个群体中活细胞的百分比。然而，许多毒性因素并不直接导致细胞死亡，而是引起细胞形态、代谢或细胞内功能的改变，使细胞丧失分裂能力，但细胞本身仍然存活。这种细胞生理能力的表现被定义为细胞生命力（vitality）。细胞活力与细胞生命力代表了细胞功能的两个不同层面，二者对于全面评估细胞在应激后的生理状态都必不可少。
酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）是研究细胞应激反应的理想模式生物。本研究的目的是建立一套清晰的酵母细胞活力与生命力检测方法分类体系，并利用过氧化氢（hydrogen peroxide, H₂O₂）、烯丙醇（allyl alcohol）和甲萘醌（menadione）三种已知氧化剂处理野生型（wild-type, WT）菌株和 dsod1 突变株（缺乏超氧化物歧化酶1，对氧化应激高度敏感），对这些方法进行比较分析。
研究方法与流程
研究首先建立了一套基于检测原理的分类体系。细胞活力检测方法分为两大类：第一类是基于细胞在固体或液体培养基上的生长能力，包括斑点试验（spotting test）和菌落形成单位计数（colony-forming unit, CFU）；第二类是基于染色方法，包括亚甲蓝（methylene blue）、碘化丙啶（propidium iodide, PI）与荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate, FDA）双染等。细胞生命力检测方法则分为三类：基于萤光素反应测定细胞ATP含量、基于罗丹明123（rhodamine 123）或罗丹明B（rhodamine B）染色测定线粒体膜电位、以及基于酶活性测定（如酯酶、氧化还原酶等）。此外，还包括酵母特异性染料 FUN-1 和基于 WST-8 的 Cell Counting Kit-8 方法。
实验使用指数期酵母细胞，经离心、洗涤后悬浮于含0.1%葡萄糖和1 mM EDTA的磷酸缓冲液（pH 7.0）中，细胞密度为 10⁸ cells mL⁻¹。细胞分别用10 mM H₂O₂、0.4 mM烯丙醇和0.105 mM甲萘醌处理1小时，然后进行各种活力与生命力检测。每个实验至少进行三次生物学重复，每次至少计数200个细胞。
斑点试验中，细胞被稀释至 10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ cells mL⁻¹，每个浓度取5 μL点在YPD固体培养基上，48小时后观察生长情况。CFU法将细胞稀释至 10³ cells mL⁻¹，取100 μL涂布于YPD平板，48小时后计数菌落。亚甲蓝染色使用0.1 mg mL⁻¹染液孵育5分钟，活细胞无色，死细胞呈蓝色。PI/FDA双染使用5 μg mL⁻¹ PI和10 μg mL⁻¹ FDA避光孵育20分钟，在荧光显微镜下活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。Cell Counting Kit-8基于WST-8钠盐被细胞脱氢酶还原为橙色甲臜产物，450 nm处测定吸光度，吸光度与活细胞数成正比。FUN-1染色使用0.5 μM染液孵育15分钟，通过荧光酶标仪测定红色荧光（575 nm）与绿色荧光（535 nm）的比值，同时用荧光显微镜观察代谢活性细胞（含红色荧光液泡内圆柱状结构）和代谢失活细胞（弥散绿色荧光）。ATP含量测定使用 BacTiter-Glo™ 微生物细胞活力检测试剂盒，通过萤光素酶反应产生化学发光信号，信号强度与ATP含量成正比。线粒体膜电位检测分别采用25 μM罗丹明123（绿色荧光）和100 nM罗丹明B（红色荧光），在荧光显微镜下观察线粒体网络和膜电位变化。
统计分析使用SPSS 21.0软件，采用独立样本t检验比较两种酵母菌株之间的差异，采用单因素方差分析（ANOVA）和 Dunnett 检验比较CFU法与其他活力检测方法之间的差异，以P < 0.05为显著性水平。
主要结果
斑点试验显示，与对照组相比，1小时氧化剂处理导致 dsod1 突变株约50%的生长抑制（四个斑点中仅两个生长），而野生型菌株未见生长变化。然而，CFU法显示 dsod1 突变株在所有测试氧化剂处理后完全丧失生长能力，野生型菌株在H₂O₂、烯丙醇和甲萘醌处理后的存活率分别约为37%、14%和99%，与斑点试验结果差异显著。这种差异可能因为斑点试验中细胞相互堆叠，减少了与氧化剂的直接接触，且斑点试验属于定性—半定量方法，仅能观察到少数细胞生长即记为“+”，而CFU法只能检测到能够分裂的细胞，无法区分“不能分裂但存活”的细胞。
为解决上述问题，作者采用荧光染料 phloxine B 进行延时显微摄影观察。该方法能区分三类细胞：能分裂的活细胞（无色）、不能分裂的活细胞（无色但不增殖）和死细胞（红色）。在野生型菌株中，H₂O₂和烯丙醇处理后可观察到分裂细胞、不分裂细胞和死细胞混合存在，而甲萘醌处理组中仍可见分裂细胞。在 dsod1 突变株中，所有氧化剂处理均导致大量死细胞出现，且生长明显受抑制。phloxine B方法虽然是非定量方法，但其优势在于简单快速，能同时区分死细胞与不能分裂的活细胞。
亚甲蓝染色结果显示，野生型菌株经H₂O₂、烯丙醇和甲萘醌处理后的存活率分别约为90%、60%和94%，dsod1 突变株分别约为85%、56%和91%。PI/FDA双染结果与亚甲蓝染色几乎一致。与CFU法相比，染色法检测到的存活率显著更高，因为染色法能够识别那些仍然存活但已丧失分裂能力的细胞。Cell Counting Kit-8法在培养3小时后，野生型菌株的细胞活力分别约为66%、57%和153%，dsod1 突变株约为53%、47%和102%。这些数值介于染色法和CFU法之间，因为该方法的结果受细胞分裂能力和世代时间的影响。
细胞生命力方面，FUN-1染色显示野生型菌株经H₂O₂和烯丙醇处理后代谢活性显著下降（分别为对照的约36%和11%），甲萘醌处理影响较小（约93%）。dsod1 突变株在所有氧化剂处理后代谢活性几乎完全丧失。ATP含量测定显示野生型菌株经三种氧化剂处理后的ATP含量分别约为对照的35%、46%和51%，dsod1 突变株约为26%、60%和66%。线粒体膜电位检测表明，H₂O₂和烯丙醇导致线粒体膜电位显著下降，甲萘醌的影响相对较小，dsod1 突变株的变化比野生型更明显。
结论与意义
本研究建立了一套系统的酵母细胞活力与生命力检测方法分类体系，并通过氧化应激模型比较了不同方法的优缺点。研究发现，基于生长的方法（CFU法）会低估细胞活力，因为该方法将所有不能分裂的细胞都归为死细胞。染色法能够更客观地反映细胞死亡率，但对细胞生理状态的刻画不够全面。细胞生命力检测方法（如FUN-1、ATP含量和线粒体膜电位）能够提供关于细胞代谢状态的详细信息，有助于解释毒性因子作用机制。
作者建议在毒理学和工业微生物学研究中，不应仅采用单一方法，而应结合多种活力与生命力检测方法，以获得全面、综合的结果。这一建议对于优化工业微生物工艺和深入理解毒性因子作用机制具有重要的科学指导价值和实际应用意义。
研究亮点
本研究的亮点在于：（1）提出了系统化的酵母细胞活力与生命力方法分类框架；（2）通过多种方法的直接比较，揭示了活力与生命力两个概念的本质区别；（3）引入 phloxine B 延时显微摄影法区分“不能分裂但存活”的细胞，弥补了CFU法的不足；（4）将活力检测（如CFU、染色法）与生命力检测（如代谢活性、ATP含量、线粒体膜电位）有机结合起来，为酵母应激研究提供了更完整的实验策略。