本研究由上海师范大学、华东师范大学、西班牙阿尔梅里亚大学及山东贝拉基因生物技术有限公司的研究人员合作完成，通讯作者为Chanjuan Mao、Jinshan Zhang和Xiaoguo Zhu。论文发表于 *Plant, Cell & Environment*，2025年第48卷，页码8573–8585，DOI为10.1111/pce.70148，接收日期为2025年8月20日。
一、研究背景与目的
根系健康发育是植物高效吸收水分和养分的基础。微小RNA（microRNA，miRNA）作为重要的基因表达调控因子，在植物根系发育中发挥关键作用。已有研究表明，miR160、miR167、miR393和miR390等通过调控生长素信号通路影响根系生长和侧根形成。然而，在水稻中，miR444家族对根系发育的调控机制尚不清晰。miR444家族是禾本科植物中特异表达的miRNA家族，在水稻中包含六个主要成员：miR444a、miR444b、miR444c、miR444d、miR444e和miR444f。以往研究多集中于miR444a和miR444b在免疫与胁迫响应中的作用，对miR444c、miR444d、miR444e和miR444f在根系发育中的功能了解甚少。已有线索表明，miR444家族可能通过靶向MADS-box转录因子OsMADS27和OsMADS57，进而影响赤霉素（gibberellin，GA）代谢和根系生长。因此，本研究旨在揭示miR444f在水稻根系发育中的具体功能及其分子机制，为通过遗传工程优化作物根系构型提供理论依据。
二、研究流程与方法
研究首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在粳稻品种日本晴（Nipponbare）背景下构建了miR444f功能缺失突变体。通过设计特异性单导向RNA（single guide RNA，sgRNA）靶向miR444f成熟序列区域，获得了两个突变株系：miR444f-1和miR444f-2，分别缺失5个和2个碱基。利用RNA-fold软件预测突变后pre-miR444f的二级结构变化，并通过茎环RT-qPCR确认成熟miR444f表达缺失。同时，通过潜在脱靶位点测序排除了脱靶效应。水稻材料分别在上海和海南陵水两地正常季节种植，水培实验在人工气候箱中进行。
在表型分析中，研究者在幼苗期第7天和第15天测量主根长度、侧根长度、不定根数量和不定根长度。利用洋红乙酸染色观察根尖分生组织，统计分生组织长度和细胞密度。通过RT-qPCR检测根尖中细胞周期相关基因CYCB1;1、CYCD1;1、CYCD2;1、CYCD3;1和CDKA;1的表达水平。采用硝基蓝四氮唑（nitro blue tetrazolium，NBT）染色观察侧根原基形态。利用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）观察成熟区和伸长区的根毛及细胞形态，并通过半薄切片和石蜡切片统计中柱鞘细胞数量和根毛密度。
为验证miR444f的靶基因，研究者从植物非编码RNA数据库（Plant Non-coding RNA Database，PNRD）预测OsMADS27和OsMADS57含有miR444f结合位点。进一步在烟草（*Nicotiana benthamiana*）叶片中进行瞬时共表达实验，将p35S::OsMADS57-EGFP或p35S::OsMADS27-EGFP分别与p35S::miR444f共同注射，48小时后用激光共聚焦显微镜检测荧光强度。同时通过RT-qPCR检测水稻根部OsMADS27和OsMADS57的表达水平。
随后，研究者分析赤霉素代谢变化。利用液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）测定水稻根部GA3含量。通过RT-qPCR检测GA合成相关基因OsGA20ox1、OsGA20ox2、OsCPS1、OsGA3ox1、OsGA3ox2、OsKO2和GA降解相关基因OsGA2ox3、OsEUI1的表达。同时测定GA信号通路负调控因子OsSLR1及其同源基因OsSLRL1的mRNA水平，并利用蛋白质印迹（western blot）检测OsSLR1蛋白水平。最后，在含有0.35 mmol/L GA3的营养液中培养miR444f突变体14天，统计主根和侧根长度，验证外源GA对根系缺陷的恢复作用。
此外，研究还在田间条件下考察了miR444f敲除对株高、穗长、剑叶长度、剑叶面积、分蘖数、地上部生物量、每穗粒数和千粒重等农艺性状的影响。
三、主要结果
表型分析显示，miR444f敲除导致幼苗期主根和侧根显著缩短。第7天时，miR444f-1和miR444f-2主根长度分别比野生型减少40.29%和45.0%；侧根长度分别减少49.60%和81.65%。第15天时，主根长度仍分别减少30.83%和36.86%，侧根长度减少50.18%和53.87%。不定根数量无显著变化，但第7天不定根长度显著缩短，到第14天差异消失，表明miR444f主要在早期生长阶段影响根系发育。
根尖分生组织观察显示，miR444f突变体根尖分生组织长度比野生型显著缩短38.65%和36.49%，细胞密度分别降为野生型的0.59倍和0.68倍。细胞周期基因CYCB1;1、CYCD1;1、CYCD2;1、CYCD3;1和CDKA;1的表达在突变体中均显著下调，其中CDKA;1的表达量在miR444f-1和miR444f-2中仅为野生型的0.14倍和0.09倍，说明miR444f缺失抑制了根尖分生组织的细胞增殖活性。NBT染色显示侧根原基形态无明显差异，表明miR444f主要影响根尖分生组织功能。
扫描电镜和半薄切片分析显示，突变体成熟区侧根长度缩短，伸长区根毛长度显著减小，平均值从野生型的69.37 μm降至22.62 μm。根毛密度也显著降低。中柱鞘细胞数量从野生型的18±2减少到突变体的14±2，表明侧根形成的细胞基础受到削弱。
在分子机制层面，烟草瞬时表达实验证实，miR444f共表达可显著降低OsMADS27-EGFP和OsMADS57-EGFP的荧光强度，说明miR444f直接抑制这两个MADS-box基因的表达。水稻根部RT-qPCR显示，突变体中OsMADS57和OsMADS27的表达分别升高3倍和2倍。这些结果表明OsMADS27和OsMADS57是miR444f的直接靶基因。
赤霉素代谢分析显示，miR444f突变体根部GA3含量仅为野生型的14.9%和44.3%。GA降解基因OsGA2ox3和OsEUI1表达分别上调2.72倍和1.98倍。GA合成基因OsGA20ox1、OsGA20ox2和OsCPS1表达显著下调，而OsGA3ox1和OsGA3ox2表达上调。OsSLR1的mRNA水平在两个突变体中分别升高8.58倍和4.54倍，OsSLR1蛋白水平也显著增加。外源GA处理14天后，miR444f突变体主根长度恢复至与野生型相当，侧根长度甚至超过野生型。
田间农艺性状分析显示，miR444f突变体株高降低17.51%和19.52%，穗长缩短18.77%和16.88%，剑叶长度和面积增加，分蘖数增加27.42%和23.21%，地上部生物量增加36.02%和15.63%。但每穗粒数减少31.22%和23.69%，千粒重降低15.62%和21.59%。
四、结论与意义
本研究揭示了miR444f在水稻根系发育中的关键调控作用。miR444f通过直接抑制OsMADS27和OsMADS57的表达，调节赤霉素代谢通路：OsMADS57调控GA降解基因OsGA2ox3和OsEUI1的表达，而OsMADS27调控DELLA蛋白基因OsSLR1的转录。miR444f缺失导致OsMADS27和OsMADS57表达升高，进而抑制GA合成、促进GA降解，并积累OsSLR1蛋白，最终抑制根尖分生组织细胞分裂和伸长，导致主根和侧根缩短。外源GA能够恢复突变体根系生长缺陷，证实GA信号通路在miR444f调控根系生长中的核心地位。此外，miR444f还影响水稻株高、生物量和产量构成因子，其敲除导致植株变矮、生物量增加但籽粒产量下降。该研究丰富了对miR444家族成员功能多样性的认识，为通过精准调控植物激素代谢网络优化作物根系构型和提高环境适应性提供了新的分子靶点和科学基础。
五、研究亮点
本研究的亮点包括：首次系统揭示了miR444f在水稻根系发育中的功能；明确了miR444f通过同时靶向OsMADS27和OsMADS57协调赤霉素合成、降解和信号转导的多层次调控机制；利用CRISPR/Cas9技术构建特异性突变体并结合细胞学、分子生物学和质谱分析手段，从表型到分子机制形成了完整证据链；发现外源GA可恢复突变体根系缺陷，为生产实践中通过激素调控改善作物根系提供了实验依据；同时揭示了miR444家族不同成员在根系调控中的功能差异，为禾本科作物根系遗传改良提供了新视角。