galectin-3 折叠结构域与无序区中的少数带电残基调控相分离

本研究由 yung-chen sun、tsung-lun hsieh、chia-i lin、wan-yu shao、yu-hao lin 和 jie-rong huang 等人完成，其中 yung-chen sun 与 tsung-lun hsieh 为共同第一作者，jie-rong huang 为通讯作者。研究单位包括台湾阳明交通大学（national yang ming chiao tung university）生物化学与分子生物学研究所、分子医学台湾国际研究生项目（与中央研究院合办）、生命科学系与基因组科学研究所，以及生物医学信息学研究所。该研究发表于 advanced science 期刊，文章于 2024 年 9 月 9 日在线发表，doi 为 10.1002/advs.202402570。

本研究属于蛋白质生物物理与细胞生物化学领域，聚焦于固有无序区（intrinsically disordered regions, idrs）介导的液液相分离（liquid–liquid phase separation, llps）机制。许多蛋白质通过相分离形成无膜细胞器（biomolecular condensates）以在时空上精确调控其功能。相分离行为受“粘性元件与间隔区模型”（stickers-and-spacers model）支配，其中粘性元件促进分子间相互作用，而间隔区增强柔性与溶解性。吸引力和排斥力的平衡受多种因素调控，包括翻译后修饰和 ph 变化。galectin-3 是一种重要的溶酶体损伤标记蛋白，其功能与细胞内吞、自噬调控及糖蛋白分选密切相关。然而，galectin-3 如何响应不同 ph 环境，以及其无序区中稀疏分布的带电残基在相分离和聚集中扮演何种角色，此前尚不清楚。作者此前已证明 galectin-3 的相分离受蛋白浓度和盐浓度调控，且其 n 端无序结构域（n-terminal domain, ntd）与碳水化合物识别结构域（carbohydrate recognition domain, crd）的非糖结合面（f-face）之间存在“模糊”的分子内及分子间相互作用。本研究旨在系统阐明 galectin-3 中少数带电残基——ntd 中仅有的两个天冬氨酸（asp-3、asp-9）和 crd 表面上的三个正电残基（arg-129、lys-199、lys-210）——如何通过阳离子-π（cation-π）、π-π 和静电相互作用共同调控蛋白质凝聚和功能。

作者进行了多层次的实验分析和生物信息学分析。首先，他们通过搜索脊椎动物蛋白质组中 galectin-3 crd 的同源序列，并结合 iupred3 预测无序性，识别出 1263 个含长无序区的 galectin-3 样蛋白。分析发现，其中超过一半的序列的 idr 含有高于蛋白质组平均水平的芳香族残基，且超过一半序列的 idr 具有净负电荷，但其中近三分之二的负电荷残基含量低于 3%。alphafold2 结构预测显示，从斑马鱼到海七鳃鳗等远缘脊椎动物中，正电残基在 f-face 的空间分布高度保守。

在此基础上，作者构建了涵盖 12 种单点、双点和三点突变体的 galectin-3 蛋白，突变位点包括 crd 上的 r129g、k199q、k210q、k199e、k210e，以及 ntd 中的 d3g、d9g 和 d3/9g。通过 1h-15n hsqc 核磁共振（nmr）谱在单相区（低蛋白浓度、无盐条件）检测 ntd/crd 分子内相互作用的化学位移扰动。结果显示，去除 crd 上正电残基显著减弱了 ntd/crd 相互作用，尤其是 k210q 突变导致 f-face 标志性残基 ala-216 的化学位移发生最大偏移。双点和三点突变体的扰动进一步加强，但仍未完全消除相互作用。加入低浓度尿素或 1,6-己二醇破坏疏水相互作用后，化学位移进一步移动。这些结果证明 crd 上正电残基通过阳离子-π 相互作用参与 ntd/crd 分子内识别，同时疏水作用也有贡献。横向弛豫速率（r2）实验和不同蛋白浓度下的 nmr 谱进一步证实，正电残基去除后分子间自缔合能力下降。在相分离实验中，gee 突变体（r129g/k199e/k210e）在相同蛋白和盐浓度下的凝聚水平显著低于 gqq 突变体和野生型，表明正电残基的丧失削弱了相分离能力。脂多糖（lipopolysaccharide, lps）凝集实验显示，突变体的凝集能力也下降，其中 gee 突变体下降约 50%。

对于 ntd 中的两个天冬氨酸残基，作者构建了仅含 ntd 的突变体。光学密度测量表明，野生型 ntd 在蛋白浓度低于 300 μm 和 500 mm nacl 条件下不凝聚，而 d3g、d9g 和 d3/9g 突变体在更低浓度下即可发生相分离，且该凝聚具有温度可逆性。全长 d3/9g 突变体也表现出更低的相分离阈值，但同时更容易形成不可逆聚集体，其形态呈现“海胆”或“星芒”状，与 fus 蛋白病理性突变体的聚集体相似。值得注意的是，d3/9g 突变体与野生型之间在 f-face 残基的化学位移上没有显著差异，说明这两个天冬氨酸并不参与 ntd/crd 相互作用，而是通过静电排斥调节 ntd/ntd 自缔合。lps 凝集实验显示 d3/9g 突变体的凝集能力仅略低于野生型，表明其相分离倾向的增强与凝集能力的变化并不完全一致。

在 ph 依赖性实验中，全长 galectin-3 在较低 ph 条件下凝聚水平增加，但这种凝聚并非总是温度可逆。仅含 ntd 的构建体在 ph 5 和 ph 6 且无盐条件下即可发生可逆的液液相分离。通过比较全长蛋白与 crd-only 蛋白在 ph 6.8 至 ph 4 滴定中的化学位移差异，作者发现 f-face 残基的扰动最为显著，提示低 ph 下 ntd/ntd 缔合增强可能减弱了 ntd/crd 相互作用。lps 凝集实验显示，尽管低 ph 下自组装倾向增强，但凝集能力显著下降，尤其是在 ph 4 时几乎消失。nmr 滴定实验证实，crd 与乳糖的结合亲和力随 ph 降低而减弱，这与先前的研究一致。此外，野生型 galectin-3 在 ph 4 时形成的聚集体形态与 d3/9g 突变体在 ph 7 时形成的“海胆”状聚集体明显不同，表明部分质子化的天冬氨酸侧链仍能提供一定的排斥力，减缓纤维化聚集。

综合以上结果，作者提出了 galectin-3 的凝集调控机制模型：凝集过程主要依赖于相邻分子 ntd 之间的分子间 π-π 相互作用，以及 ntd 与 crd f-face 正电残基之间的阳离子-π 相互作用。ntd 中的两个天冬氨酸残基通过静电排斥调节自组装倾向，并在不同 ph 条件下感知环境变化，防止 prion 样无序区快速形成不可逆纤维化聚集。这一机制解释了 galectin-3 在溶酶体破裂等 ph 波动情境下的功能调控：在中性 ph 环境中有效凝集糖基化分子，而在囊泡修复后 ph 下降时降低结合亲和力并从配体上解离。负电荷残基的防聚集作用可能有利于 galectin-3 的再循环和内体运输。

本研究的科学价值在于揭示了无序区中极少数负电荷残基如何在保持相分离功能的同时抑制病理性聚集，强调了阳离子-π、π-π 和静电相互作用在无序结构域与折叠结构域之间的协同调控。研究还指出，galectin-3 中 ser-6 和 ser-12 的磷酸化可能通过引入额外负电荷进一步减弱自缔合，为理解翻译后修饰调控提供了功能基础。此外，作者提出 alix 蛋白的 c 端无序区与 galectin-3 ntd 之间的异型相分离也可能受局部 ph 变化调控，为内吞膜修复机制研究提供了新方向。

研究的亮点包括：系统性的突变分析和多维度生物物理技术联用；将分子内 ntd/crd 相互作用与分子间相分离和功能凝集实验相结合；利用进化保守性分析验证关键带电残基的功能重要性；以及阐明少数负电荷残基在 prion 样无序区中的“刹车”作用。该工作为理解细胞内大量含 idr 的蛋白质如何在功能组装与不可逆聚集之间维持平衡提供了重要范例。