研究报告：双子叶植物内含子对单子叶植物外源基因表达的增强作用及其机制
1. 研究作者与发表信息
本研究由Akira Tanaka（通讯作者）、Satoru Mita、Shozo Ohta、Junko Kyozuka、Ko Shimamoto和Kenzo Nakamura合作完成，分别来自日本横滨Plantech研究所和名古屋大学生物化学实验室。论文标题为《Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice but not in tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficient splicing of the intron》，发表于1990年11月的《Nucleic Acids Research》第18卷第23期。
2. 学术背景与研究目标
本研究属于植物分子生物学领域，聚焦内含子（intron）对外源基因表达的调控机制。此前研究表明，内含子可通过促进前体mRNA（pre-mRNA）剪接和成熟mRNA积累增强基因表达，但这种现象在单子叶（monocot）和双子叶（dicot）植物间存在差异。例如，玉米酒精脱氢酶基因（adh-1）的内含子能显著提高单子叶植物（如水稻、小麦）中外源基因的表达，但对双子叶植物（如拟南芥）无效。然而，双子叶植物内含子对单子叶植物的作用机制尚不明确。
本研究旨在探究双子叶植物蓖麻（castor bean）过氧化氢酶基因（cat-1）的第一个内含子在水稻（单子叶）和烟草（双子叶）中对报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶（gusA）表达的影响，并分析其与mRNA剪接效率及转录水平的关联。
3. 研究流程与方法
（1）载体构建
- 将cat-1内含子插入gusA基因的N端编码区（位于起始密码子ATG下游15 bp处），构建含内含子的质粒pIG221；对照质粒pBI221不含内含子。
- 通过位点定向诱变（site-directed mutagenesis）在内含子3’剪接位点上游6 bp处引入终止密码子TAG，防止内含子序列被翻译。
（2）植物转化与表达分析
- 水稻：采用电穿孔法（electroporation）将质粒导入水稻原生质体（protoplast）和愈伤组织（calli），检测瞬时和稳定转化后的GUS酶活性。
- 烟草：通过农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）转化烟草植株，检测叶片、根和茎中的GUS活性。
- 样本量：水稻原生质体实验包含3组独立重复；烟草实验使用多个独立转化株系。
（3）Northern blot分析
- 提取水稻愈伤组织和烟草叶片的total RNA及poly(A)+ RNA，用gusA基因或cat-1内含子序列作为探针杂交，检测成熟mRNA（1.8 kb）和未剪接转录本（2.0 kb）的水平。
（4）剪接位点测序
- 通过逆转录PCR（RT-PCR）扩增水稻和烟草中gusA的cDNA，克隆并测序剪接连接区，验证剪接位点的选择。
4. 主要结果
（1）内含子显著增强水稻中的GUS表达
- 在水稻原生质体中，pIG221的GUS活性比pBI221高10–40倍；在愈伤组织和根中增强80–90倍。
- 烟草中，pIG221仅使GUS活性提高1.7–2.2倍，表明内含子的增强作用具有物种特异性。
（2）剪接效率与mRNA水平的关系
- 水稻：Northern blot显示pIG221转化的愈伤组织仅检测到1.8 kb的成熟mRNA，且其丰度是pBI221的10倍，证明内含子高效剪接并促进mRNA积累。
- 烟草：同时存在1.8 kb（剪接）和2.0 kb（未剪接）转录本，且两者丰度相近，表明剪接效率低下。
（3）剪接位点选择保守
- 测序发现，水稻和烟草均使用人工引入的3’剪接位点（AG），而非天然位点。这一现象支持“剪接体（spliceosome）通过扫描选择第一个下游AG”的假说。
5. 结论与意义
本研究首次证明双子叶植物内含子可显著增强单子叶植物中外源基因的表达，其机制与高效剪接和成熟mRNA积累直接相关。此外，人工设计的剪接位点能被异源物种准确识别，为基因工程中内含子的优化提供了新思路。科学价值在于揭示了植物剪接机制的保守性与物种差异性，应用价值体现在单子叶作物（如水稻）遗传转化效率的提升。
6. 研究亮点
- 创新性发现：双子叶内含子在单子叶植物中的高效剪接与其增强表达的直接关联。
- 方法学贡献：通过人工剪接位点设计验证了剪接体的选择机制。
- 跨物种比较：明确单子叶与双子叶植物在RNA加工 machinery 上的差异。
7. 其他价值
- 研究为后续探索内含子序列与剪接效率的关系奠定了基础，例如内含子二级结构或外显子 flanking 序列的作用。