人工光合作用新突破：基于视紫红质构建工程菌实现高效二氧化碳固定

一、 研究团队与发表信息

本研究由英国牛津大学工程科学系的Weiming Tu、Jiabao Xu、Ian P. Thompson和Wei E. Huang（通讯作者）共同完成。研究成果以“Engineering artificial photosynthesis based on rhodopsin for CO2 fixation”为题，于2023年发表在学术期刊 Nature Communications 上。

二、 学术背景与研究目标

本研究属于合成生物学、微生物电化学和人工光合作用交叉领域。自然界的光合作用是全球碳循环和初级生产力的基础，其中微生物贡献了约一半的份额。传统的光合作用依赖于叶绿素基的复杂光系统（Photosystem I和II），而另一种更简单的光能捕获系统——微生物视紫红质（Microbial Rhodopsin）——虽广泛存在于海洋微生物中，能够通过光驱动质子泵产生质子动力势（Proton Motive Force, PMF），但因其自身不产生电子，长期以来被认为无法独立驱动二氧化碳（CO2）固定。

近年来，有研究表明视紫红质产生的PMF可以驱动电子传递链（Electron Transport Chain, ETC）反向运行，从而再生还原力（如NADH/NADPH），这为利用视紫红质进行固碳提供了理论可能。同时，一些化能自养微生物（如 *Ralstonia eutropha*）能够利用无机物或电极作为电子供体来固定CO2。然而，如何高效地将外部电子导入细胞并与内部光能捕获系统耦合，是实现高效人工光合作用的关键挑战。

本研究旨在将视紫红质的光驱动质子泵能力与来自电活性细菌的外膜电子摄取机制相结合，构建一个全新的人工光合作用系统。具体目标是在一株兼性化能自养土壤细菌——Ralstonia eutropha H16（亦称 *Cupriavidus necator*）中，建立一个由光驱动的光电合成（Photoelectrosynthetic）CO2固定途径。该系统模仿自然光合作用，利用太阳能分解水提供电子，通过工程化的微生物细胞将CO2和水转化为生物质。

三、 详细研究流程与方法

本研究包含一个系统性的工程构建、验证与优化流程，具体步骤如下：

1. 构建合成电子传递链 * 研究目标与对象：为 R. eutropha 引入一个高效的跨膜电子传递界面，使其能够直接从外部阴极摄取电子。 * 方法：研究人员从模式电活性细菌 Shewanella oneidensis MR-1中，将编码外膜细胞色素导电通道复合物MtrCAB的基因簇（*mtrcab*），克隆到一个阿拉伯糖诱导型质粒上，并转入 R. eutropha H16，构建工程菌株 R. eutropha-Mtr。 * 验证实验： * 蛋白表达验证：通过细胞沉淀颜色（变红）、单细胞拉曼光谱（细胞色素特征峰增强）以及蛋白质免疫印迹（检测血红素c蛋白），证实MtrCAB复合物在 R. eutropha 中成功表达。 * 功能验证：将工程菌置于电化学生物反应器的阴极室，以硝酸盐作为终端电子受体。实验发现，只有在阿拉伯糖诱导表达MtrCAB的情况下，加入硝酸盐才会引起阴极电流的显著下降，证明电子能够通过Mtr途径从电极传递至细胞内的硝酸盐还原酶。这标志着工程菌成功建立了细胞能量代谢与电极之间的电学连接。

2. 结合视紫红质光系统 * 研究目标与对象：将电子摄取系统与光能捕获系统耦合，以驱动还原力（NADH/NADPH）的生成。 * 方法：将来自 Gloeobacter violaceus 的视紫红质基因（*gr*）与 mtrcab 构建在同一个质粒上，转入 *R. eutropha*，得到工程菌株 R. eutropha-Gr-Mtr。该菌株同时具备从电极摄取电子的Mtr途径和光驱动质子泵Gr。 * 验证实验： * 蛋白表达验证：诱导后的细胞沉淀呈粉红色，单细胞拉曼光谱检测到视紫红质特征峰（~1530 cm⁻¹），证实Gr成功表达。 * 功能验证：在光照和阴极供电子条件下培养 R. eutropha-Gr-Mtr。检测发现，与黑暗条件相比，光照下细胞内的NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺比值显著升高，且NADPH的增幅更为明显。这证明光激活的Gr产生的质子动力势，驱动了电子传递链反向运行，成功将外部电子转化为细胞内固碳所需的还原力。

3. 验证光驱动CO2固定代谢 * 研究目标与对象：证明工程菌能利用光能和电极提供的电子，以CO2为唯一碳源进行代谢活动。 * 方法：使用重水（D₂O）作为代谢探针。代谢活跃的细胞会将氘（D）掺入新合成的生物分子（如氨基酸）中，形成碳-氘（C-D）键，这可以通过拉曼光谱中C-H键振动峰向C-D键振动峰区的偏移来检测。 * 实验与结果：将 R. eutropha-Gr-Mtr在四种条件下（光照/黑暗 × 有CO₂/无CO₂）于含D₂O的阴极室中培养。单细胞拉曼分析显示，仅在“光照且有CO₂供应”的条件下，细胞光谱中出现了显著的C-D振动峰，表明细胞发生了活跃的、依赖于光和CO₂的代谢。而缺乏Mtr途径的对照菌株（R. eutropha-Gr）即使在光照和CO₂下也未见C-D峰，突出了Mtr介导的电子摄取对驱动该代谢的必要性。这直接证明了工程菌已转变为一种光-电-自养型微生物。

4. 构建完整人工光合系统并优化效率 * 研究目标与对象：建立一个完全由太阳能驱动的、可自我维持的CO2固定与生物质合成系统，并通过模块化工程策略优化其效率。 * 系统构建：使用太阳能电池板为整个电化学系统供电，通过电压调节器稳定阴极电位。选用一株不能合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）的 R. eutropha 突变体（Rhm5）作为底盘，以最大化碳流向生物质合成。 * 模块化优化策略： * 优化电子传递：添加黄素单核苷酸（FMN）作为电子介体，其可与MtrC结合。拉曼光谱证实FMN与Mtr结合。与仅使用黄素作为自由穿梭介体的旧系统相比，表达Mtr途径的系统使细胞倍增时间几乎减半，法拉第效率（Faradaic Efficiency）从23.9%提升至35.4%，总电荷转移量提高了54.4%，证明了Mtr途径建立了更高效的电子传递路径。 * 优化光能捕获：添加角黄素（Canthaxanthin）作为Gr的“天线”分子。实验证实，Gr-角黄素复合物的质子泵能力比单独的Gr几乎翻倍。在人工光合系统中，添加角黄素使工程菌的倍增时间进一步缩短22%，法拉第效率提升至42.9%。 * 优化CO2固定模块：过表达 R. eutropha 自身的碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, Can）。该酶催化HCO₃⁻与CO₂的相互转化，加速CO₂的利用。使用¹³C-碳酸氢盐培养实验证明，过表达Can的菌株能将更多¹³C掺入生物质。在完整系统中，过表达Can使倍增时间进一步缩短至最低67.3小时。 * 最终性能：整合了Mtr、Gr-角黄素复合物和过表达Can的最终工程菌株（Rhm5-Gr-Mtr-Can），在纯CO₂氛围、光照和太阳能供电条件下成功生长（OD600从~0.1增长至0.237），而所有黑暗对照均不生长。其法拉第效率达到45.0%。

5. 研究方法学亮点 * 单细胞拉曼光谱（Single-Cell Raman Spectroscopy, SCoRS）：本研究广泛应用该技术进行无标记、原位、单细胞水平的分析。用于：（1）定量细胞色素c表达水平；（2）检测视紫红质和角黄素的存在；（3）通过C-D峰探测代谢活性；（4）通过苯丙氨酸特征峰的¹³C同位素偏移定量碳同化效率。这是一种强大的表型分析工具。 * 光电化学生物反应器：设计并使用了双室反应器，由质子交换膜隔开，阳极进行水分解产氧，阴极室维持厌氧环境进行微生物CO₂固定，避免了活性氧（ROS）对细胞的损害。

四、 主要研究结果及其逻辑关联

1. 成功在 R. eutropha 中构建并验证了异源Mtr电子摄取途径。细胞色素表达和硝酸盐呼吸电流实验证实了该途径的功能性，为后续与光系统的耦合提供了电子入口。
2. 成功将Mtr途径与Gr视紫红质光系统耦合，实现了光驱动还原力再生。NAD(P)H水平在光照下显著提升的结果，证明了Gr产生的质子动力势可以驱动电子反向传递，克服从醌池到NAD⁺的热力学障碍，这是将外部电子转化为生物合成所需化学能的关键步骤。
3. 首次实现了基于视紫红质和Mtr途径的光-电-自养代谢。D₂O标记实验提供了直接证据，表明只有在光、CO₂和Mtr途径三者俱备时，工程菌才能进行活跃的、以CO₂为碳源的新陈代谢，完成了从异养菌到人工光合自养菌的功能转化。
4. 模块化工程策略显著提升了人工光合系统的整体效率。通过引入Mtr（优化电子传递）、角黄素（优化光捕获）和过表达Can（优化碳利用），系统性能（倍增时间和法拉第效率）得到逐步、显著的提升。最终系统实现了在单纯太阳能驱动下的CO₂到生物质的转化，其倍增时间（~67小时）与天然不产氧光合细菌 Rhodopseudomonas palustris 在电化学条件下的生长速率相当。

这些结果层层递进：首先建立了电子输入通道（Mtr），然后耦合了能量转换模块（Gr）证明了还原力生成，进而验证了完整的CO₂固定代谢，最后通过系统性优化实现了高效、可持续的人工光合作用。

五、 研究结论与意义

本研究成功设计并构建了一个高效的人工光合作用系统。该系统通过合成生物学手段，将来自 Shewanella oneidensis 的外膜电子传递通路（MtrCAB）和来自 Gloeobacter violaceus 的视紫红质（Gr）光系统，整合到模式化能自养菌 Ralstonia eutropha 中。该系统模仿自然光合作用的光反应过程，利用太阳能分解水提供电子，通过工程菌的Mtr途径摄入电子，并利用Gr光系统产生的质子动力势驱动细胞内还原力再生，最终通过该菌固有的卡尔文循环（Calvin-Benson-Bassham cycle）将CO₂固定转化为生物质。

科学价值： 1. 概念验证：首次实现了完全基于微生物视紫红质（而非叶绿素）的人工光合作用系统，将CO₂固定与生物质合成，拓展了我们对自然界中广泛存在的视紫红质潜在生态功能（如可能参与碳固定）的理解。 2. 路径创新：创建了一条全新的“光电合成”代谢路径，将外部物理能源（光、电）与内部生物代谢（质子泵、反向电子传递、固碳）精巧地耦合在一起。 3. 方法学示范：展示了合成生物学“模块化”工程策略的强大能力，通过分别优化电子传递、能量转换和碳固定模块，系统性提升整体系统性能。

应用价值： 1. 负碳技术：为将工业排放或大气中的CO₂直接转化为有价值的生物产品（如单细胞蛋白饲料）提供了一种有潜力的太阳能驱动解决方案。 2. 合成生物学平台：该设计原理具有普适性，为将其他非光合微生物改造为光能或电能自养菌提供了可借鉴的蓝本。 3. 基础研究工具：该工程系统本身是一个研究微生物能量转换、电子传递与碳代谢之间相互作用的理想模型。

六、 研究亮点

1. 核心创新：首次构建了一个不依赖叶绿素、完全基于微生物视紫红质和外膜电子传递复合物的人工光合作用系统，并实现了从CO₂到生物质的完整合成。
2. 高效的跨膜电子传递：异源表达 Shewanella 的Mtr途径，在 R. eutropha 中建立了高效的、膜结合的电子摄取通道，相比传统的可溶性电子穿梭体策略，显著提升了电子传递速率和效率。
3. 能量耦合机制的巧妙运用：利用视紫红质作为简单的光驱动质子泵，其产生的质子动力势用于驱动ATP合成和逆转NADH脱氢酶的功能，从而将外部低电位电子“提升”为高还原力的NAD(P)H，解决了光电合成中的关键能量瓶颈。
4. 多模态、单细胞水平的表征：综合运用电化学、生化分析和单细胞拉曼光谱等多种技术，特别是在单细胞水平上对蛋白表达、代谢活性和碳同化进行了原位、无标记的动态监测，提供了强有力的多层次证据链。
5. 系统性工程优化：不仅完成了路径构建，还通过添加角黄素天线、过表达碳酸酐酶等策略，对光捕获、电子传递和碳固定各个环节进行了有效优化，使系统性能达到了接近天然光合微生物的水平。

七、 其他有价值的内容

1. 与天然光合作用的类比与区别：作者在讨论中将该系统与天然光合作用（图5）进行了清晰类比：太阳能电池板分解水相当于光系统II的功能；Gr产生质子动力势驱动反向电子传递生成NADPH，相当于光系统I的功能。然而，该系统比天然光合系统更简单，避免了复杂的放氧过程和光损伤风险。
2. 对自然界微生物生态的启示：研究提出了一种有趣的可能性：在自然界中，如果某些自养微生物同时具备Mtr-like蛋白和视紫红质，它们或许能够利用太阳能驱动CO₂固定。这为理解海洋中广泛存在的视紫红质微生物的生态角色提供了新的假设和研究方向。
3. 对ROS问题的考虑：研究通过使用双室反应器和质子交换膜，将产氧的阳极室与厌氧的阴极室（微生物固碳场所）物理隔离，有效避免了水分解产生的氧气进入阴极室形成有害的活性氧（ROS），保障了系统的长期运行稳定性。
4. 未来优化方向：文章指出，可通过优化Mtr途径的表达、引入更多辅助蛋白（如STC）、工程化提高微生物的ROS抗性、以及进行电极材料修饰等方式，进一步提升系统效率。甚至可以通过改造视紫红质使其吸收非可见光波长，以最大化利用太阳光谱。