本文属于类型a，即单一原始研究论文，以下为该研究的详细学术报告。

本研究由中国科学院大连化学物理研究所的蔡鹏、段兴鹏、吴晓燕、高琳惠、叶敏及周雍进等人完成，其中蔡鹏与段兴鹏为共同第一作者，周雍进为通讯作者。该论文于2021年7月1日在线发表于《Nucleic Acids Research》期刊第49卷第13期，页码为7791–7805。

该研究属于合成生物学与代谢工程领域，研究对象为工业酵母——巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris，同义名Komagataella phaffii）。巴斯德毕赤酵母作为一种重要的工业微生物，已被广泛用于重组蛋白的生产，尤其是在工业酶制剂和生物制药行业。近年来，研究者逐渐关注将该酵母开发为生产小分子化学品的底盘细胞工厂。然而，与模式酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相比，巴斯德毕赤酵母在遗传操作工具方面严重匮乏，特别是其细胞内DNA双链断裂（double-strand break，DSB）修复机制以非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）为主导，而同源重组（homologous recombination，HR）效率极低，这严重阻碍了对该酵母进行精确的基因编辑和大规模的代谢途径重构。此外，可用于外源基因稳定整合的中性位点（neutral sites）数量有限，可供精细调控基因表达的启动子资源也缺乏系统性表征。因此，本研究的核心目标是系统改造巴斯德毕赤酵母的重组修复机制以提升同源重组效率，并利用建立的高效基因组编辑平台，系统鉴定基因组整合中性位点和表征多种启动子，最终实现代谢途径的双因素调控。

研究的具体工作流程主要包括以下几个环节。首先，研究者建立了基于CRISPR-Cas9的基因组编辑平台。他们以pPICZ质粒为骨架，构建了同时表达Cas9蛋白和向导RNA（guide RNA，gRNA）的表位质粒，并引入了从乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）中克隆的自主复制序列panARS，使质粒能够在巴斯德毕赤酵母中独立复制。他们还利用双向启动子pHTX1同时驱动Cas9和gRNA的表达。该系统的基因组切割效率可达93%，但在最初的实验中，提供带有1000 bp同源臂的供体DNA时，无缝基因敲除的阳性率低于1.67%，说明NHEJ在DNA双链断裂修复中占绝对优势，HR受到严重抑制。为提高HR效率，研究者尝试了多种策略，包括敲除NHEJ关键基因KU70，以及过表达来自酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母内源的HR相关基因，如ScSAE2、ScRAD52、ScRAD51、PpRAD51、PpRAD52和PpRAD54。结果发现，过表达内源PpRAD52效果最佳，使无缝基因敲除的阳性率从野生型的0%提升至77.5%。同时，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母中RAD52基因的表达水平显著低于KU70基因，这可能是其HR效率低下的重要原因。过表达PpRAD52还可以将同源臂长度缩短至200 bp仍保持较高的基因删除和整合效率。此外，该策略使三个基因同时整合到三个不同基因组位点的阳性率达到25%，而野生型菌株无法获得阳性克隆。

然而，多个DNA片段同时整合到单一基因组位点的效率仍然较低（约25%）。为此，研究者进一步改造了与多片段同源重组相关的多入侵诱导重排（multi-invasion-induced rearrangement，MIR）过程。在酿酒酵母中，Mph1解旋酶和Sgs1-Top3-Rmi1解旋酶-拓扑异构酶复合物能够破坏新生的置换环（displacement loop，D-loop），从而抑制多片段重组。因此，研究者在过表达PpRAD52的菌株中分别敲除了MPH1、SGS1、TOP3和RMI1基因，并过表达了结构选择性核酸内切酶（structure-selective endonucleases，SSEs）基因MUS81-MMS4、SLX1-SLX4和YEN1。结果显示，敲除MPH1在过表达PpRAD52的背景下，可使三个DNA片段同时整合到单一基因组位点的阳性率比野生型提高13.5倍，达到67.5%左右。进一步的组合改造并未继续提升效率，反而导致阳性率和转化子数量下降。利用分段的KanMX表达盒作为报告系统，研究者还证实了PpRAD52过表达和MPH1敲除分别在单片段整合和多片段整合过程中发挥了不同的促进作用。

在获得高效HR介导的基因组编辑平台后，研究者利用该平台系统鉴定了巴斯德毕赤酵母基因组中的中性位点。他们通过生物信息学分析，筛选了相邻开放阅读框（open reading frame，ORF）间距大于1500 bp的区域，并排除了潜在的启动子和终止子序列，最终得到53个候选位点。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达盒为报告基因，研究者成功在46个位点实现了基因整合，并发现不同位点的EGFP表达水平存在显著差异。例如，在葡萄糖培养基中，最强和最弱位点之间的荧光强度相差约3.9倍。在此基础上，研究者将脂肪酸醇（fatty alcohol）生物合成途径整合到不同中性位点，发现脂肪酸醇产量与EGFP信号积分呈正相关（相关系数r²=0.86），表明基因组位置效应可以用于代谢途径的表达调控。

在启动子表征方面，研究者在同一中性位点pNSII-5整合了18个不同启动子控制的EGFP表达盒，并在葡萄糖、甲醇以及混合碳源条件下进行了时间依赖性表达谱分析。结果显示，在葡萄糖培养基中，与糖酵解相关的启动子（如pGAP）在指数生长期表达最强，但随葡萄糖消耗而下降；与甲醇利用相关的启动子在葡萄糖培养基中被完全抑制。在甲醇培养基中，甲醇利用启动子被诱导表达，其中pDAS2和pAOX1属于强诱导型，pCAT1为中等强度，其余为弱诱导型。在葡萄糖和甲醇混合培养基中，甲醇利用启动子即使在葡萄糖耗尽后仍被严格抑制，表明葡萄糖分解代谢物对甲醇代谢具有很强的抑制作用。

基于中性位点和启动子的差异化表达特性，研究者建立了双因素调控策略。他们选择了启动子pTPI、pTEF1和pGAP以及中性位点pIV-3、pIV-9和pIV-16进行组合，发现不同组合可使EGFP表达水平产生7.3倍的变化范围。将该策略应用于脂肪酸酰基辅酶A还原酶（fatty acyl-CoA reductase，FaCoAR）的表达调控，脂肪酸醇产量在葡萄糖培养基上呈现从12.6 mg/L到380 mg/L的30倍变化范围，最高产量与经过综合改造的非产油酵母相当，证明了该双因素调控策略在代谢途径优化中的有效性。

本研究的核心结论是：通过过表达内源RAD52和敲除MPH1，可以显著增强巴斯德毕赤酵母的同源重组效率，建立高效的CRISPR-Cas9基因组编辑平台；利用该平台可系统鉴定46个基因组中性位点和18个启动子，并实现基于位点和启动子组合的双因素基因表达调控，成功将脂肪酸醇产量调控范围扩大至30倍。该研究不仅为巴斯德毕赤酵母的代谢工程提供了重要的遗传工具，也为其他非常规酵母的基因组工程和代谢途径重构提供了可借鉴的策略。

本研究的主要亮点包括：第一，首次系统地改造了巴斯德毕赤酵母的多入侵诱导重排过程，通过组合PpRAD52过表达和MPH1敲除，大幅提升了多片段同源重组效率；第二，利用建立的高效基因组编辑平台，首次在巴斯德毕赤酵母中大规模鉴定了46个基因组中性位点，并系统分析了位置效应对基因表达和代谢产物合成的影响；第三，建立了基于中性位点和启动子组合的双因素调控策略，实现了代谢途径表达水平的宽范围精确调控，为复杂代谢网络的系统优化提供了新的方法学框架。

此外，该研究还通过实时定量PCR比较了巴斯德毕赤酵母与酿酒酵母中关键HR和NHEJ基因的表达水平差异，揭示了巴斯德毕赤酵母HR效率低下的分子基础。研究结果还提示，永久性敲除KU70可能导致染色体末端大片段丢失，而通过过表达RAD52增强HR则能避免这一问题，这对于其他非常规酵母的基因组工程具有重要的警示和指导意义。