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本研究由浙江大学医学院生命科学研究院的Li Zhirong、Chen Nuo、Zhou Caixia等人完成，通讯作者为Chao Tong（ctong@zju.edu.cn），合作单位包括浙江大学医学院附属邵逸夫医院、杭州师范大学衰老研究所及深圳湾实验室神经与精神疾病研究所。论文发表于 *Molecular Cell*（第86卷，第3277–3293页），出版日期为2026年8月20日，DOI为10.1016/j.molcel.2026.06.018。
线粒体通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）为细胞提供绝大部分ATP，而糖酵解仅产生少量ATP。不同组织在不同生理或病理条件下的能量需求不同，因此线粒体OXPHOS必须随之调节。然而，OXPHOS如何感知并适应细胞能量需求变化的分子机制仍不明确。半乳糖（galactose）作为一种碳源，其代谢速率不足以支持培养细胞通过糖酵解获得足够能量，因此细胞在半乳糖培养基中被迫依赖线粒体OXPHOS，这一特性使其成为研究线粒体呼吸适应机制的理想模型。
呼吸链复合体I（complex I）是电子传递链的入口，由45个亚基组成（其中7个由线粒体DNA编码），并需要20多个装配因子协助其分步装配。其中，装配因子TIMMDC1（translocase of inner mitochondrial membrane domain containing 1）对多个亚复合体模块的组装至关重要。然而，已知的复合体I装配因子均为正调控因子，是否存在负调控机制一直未被阐明。
此前研究发现TMEM141是一个功能未知的线粒体蛋白，分子量约11 kDa，含有两个螺旋结构。该蛋白曾被发现与自杀高风险家系的序列变异相关，其双等位基因突变（p.Trp90*）与严重智力障碍有关，突变小鼠表现出学习能力和运动协调障碍。尽管有学者推测TMEM141具有生物能量学功能，但其分子机制尚不清楚。本研究旨在揭示TMEM141在调控线粒体呼吸和复合体I装配中的作用。
本研究可分为以下主要实验环节：
1. 半乳糖处理对TMEM141表达的影响。 研究人员将U2OS细胞从葡萄糖培养基切换至半乳糖培养基，在不同时间点检测TMEM141蛋白和mRNA水平。蛋白水平在96小时后降至葡萄糖条件下的16%，而mRNA水平仅在12小时轻度升高后恢复至基线，提示蛋白下调并非由于转录抑制。
2. TMEM141敲除细胞系的构建与呼吸功能检测。 利用CRISPR-Cas9技术构建U2OS TMEM141敲除（knockout, KO）细胞，通过Seahorse代谢分析仪检测细胞耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）。同时构建了TMEM141过表达（overexpression, OE）细胞系（表达水平约为内源性10倍）以及TMEM141回补（rescue）细胞系用于功能验证。
3. 呼吸链复合体装配分析。 采用蓝绿温和凝胶电泳（blue-native PAGE, BN-PAGE）分析各呼吸链复合体（complex I–V）的成熟体水平。分别使用1% DDM和2.5% digitonin两种线粒体增溶条件，后者较为温和，能保留更多亚复合体，因此后续实验均采用digitonin条件。
4. TMEM141的亚线粒体定位分析。 通过细胞分级分离、蛋白酶K（proteinase K, PK）消化实验、线粒体肿胀实验以及Na₂CO₃碱性提取实验确定TMEM141的拓扑结构。使用超分辨显微镜（Airyscan）进一步确认其与内线粒体膜（inner mitochondrial membrane, IMM）蛋白OXA1L的部分共定位。
5. TMEM141相互作用蛋白的鉴定。 利用V5标签免疫沉淀结合质谱分析（immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS）鉴定TMEM141的潜在互作蛋白。在鉴定的复合体I装配因子中，逐一验证ACAD9、DMAC2、FOXRED1、NDUFAF2和TIMMDC1与TMEM141的相互作用。进一步检测TMEM141对TIMMDC1与NDUFA9亚基相互作用的影响，以及TIMMDC1在复合体I亚复合体中掺入的变化。
6. TMEM141降解机制的探究。 使用环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）抑制新蛋白合成，比较葡萄糖和半乳糖条件下TMEM141的降解速率。通过siRNA筛选四种已知的IMM蛋白酶（AFG3L2、SPG7、YME1L1和OMA1），确定参与TMEM141降解的蛋白酶。使用催化失活突变体（AFG3L2-E408Q和YME1L1-E543Q）进行免疫共沉淀实验，检测半乳糖处理是否促进TMEM141与蛋白酶之间的相互作用。同时检测mTOR抑制剂torin 1对TMEM141水平的影响，因为此前研究表明mTOR抑制可激活YME1L1。
7. 线粒体DNA编码蛋白合成分析。 检测TMEM141 KO和OE细胞中线粒体DNA（mtDNA）编码的13个亚基的蛋白水平以及相应的mRNA水平。使用氯霉素（chloramphenicol, CAP）抑制线粒体翻译，观察已有蛋白的降解动力学；通过CAP冲洗恢复实验评估线粒体翻译能力。利用蔗糖密度梯度超速离心分析线粒体核糖体大亚基（39S）、小亚基（28S）和55S完整核糖体的组装状态。
8. 氧化损伤与cGAS-STING通路检测。 使用8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）斑点杂交和免疫染色评估氧化性DNA损伤。通过TFAM与TOMM20免疫共染色观察mtDNA是否释放至胞质，并通过qPCR定量胞质mtDNA含量。检测cGAS-STING通路中TBK1和IRF3的磷酸化水平及下游免疫基因表达。利用溴化乙锭处理构建ρ⁰细胞（mtDNA缺失细胞），以验证cGAS-STING激活是否依赖于mtDNA释放。
9. 果蝇体内功能研究。 克隆果蝇同源基因CG42488（命名为dTMEM141），在S2细胞和脂肪体中验证其线粒体定位。利用ATP-spark和GSTD1-GFP报告系统分别检测果蝇肌肉中ATP产生和ROS水平。通过CRISPR-Cas9构建dTMEM141突变果蝇（第33位氨基酸提前终止），观察老化果蝇眼睛中胶质细胞的完整性。
结果1：半乳糖处理通过降低TMEM141水平促进复合体I装配。 在对照U2OS细胞中，半乳糖处理显著增加基础呼吸、ATP产生和最大呼吸，同时所有呼吸链复合体的装配均增强，其中复合体I的增幅最为显著。然而，TMEM141 KO细胞在葡萄糖条件下已表现出增强的线粒体呼吸和复合体I装配，半乳糖处理不再进一步增强OCR，且复合体I装配的增加幅度较对照细胞显著减弱。这些结果表明TMEM141的降低介导了半乳糖诱导的复合体I装配增加。值得注意的是，呼吸链复合体亚基的蛋白表达水平在半乳糖处理后并未改变，说明该调节机制不依赖于转录或翻译水平的改变。
结果2：TMEM141是线粒体呼吸和复合体I装配的负调控因子。 TMEM141 KO细胞表现出线粒体膜电位升高、线粒体ROS增多，而OE细胞则相反；回补实验使这些指标恢复正常。BN-PAGE分析显示KO细胞中成熟复合体I（约1000 kDa）显著增加，而复合体II、III、IV和V不受影响。OE细胞中成熟复合体I减少而中间复合体增多。超分辨显微镜和生化分析确认TMEM141定位于线粒体内膜，是一种跨膜蛋白。
结果3：TMEM141通过与TIMMDC1互作抑制复合体I装配。 IP-MS鉴定出多个复合体I亚基和装配因子。逐一验证后，只有TIMMDC1能与TMEM141稳定互作。在葡萄糖条件下，内源性TMEM141和TIMMDC1双向免疫共沉淀；在半乳糖条件下，由于TMEM141蛋白水平降低，仅检测到单向沉淀。TMEM141过表达剂量依赖性地减少TIMMDC1与NDUFA9的共沉淀，表明TMEM141通过阻碍TIMMDC1与复合体I亚基的结合来抑制装配。BN-PAGE进一步显示TMEM141 KO细胞中TIMMDC1掺入复合体I亚复合体的量显著增加，回补后恢复至对照水平。TIMMDC1过表达可显著增加复合体I装配，但同时过表达TMEM141可抑制这一效应，即使TIMMDC1诱导的NDUFA13亚基表达增加仍存在。RNAi敲低HeLa细胞中TMEM141同样增强了复合体I装配和TIMMDC1掺入，表明该机制在不同细胞类型中保守。
结果4：AFG3L2和YME1L1介导半乳糖诱导的TMEM141降解。 CHX追踪实验显示TMEM141在半乳糖条件下的降解速率显著加快。siRNA筛选发现敲低AFG3L2或YME1L1（而非SPG7或OMA1）可阻断半乳糖诱导的TMEM141降解。过表达野生型AFG3L2或YME1L1可增强TMEM141降解，而蛋白酶失活突变体无此效应。mTOR抑制剂torin 1可降低TMEM141水平，与已知YME1L1底物TIM17的变化类似。重要的是，半乳糖处理并不增加AFG3L2或YME1L1的蛋白表达水平，也不改变其已知底物SLC25A39的水平，却显著增强了催化失活突变体与TMEM141的相互作用——在葡萄糖条件下检测不到互作，而在半乳糖条件下两者均能沉淀TMEM141。这表明半乳糖通过增强蛋白酶与TMEM141的底物识别来促进降解，而非通过上调蛋白酶表达或总活性。
结果5：TMEM141影响mtDNA编码蛋白的合成。 在TMEM141 KO细胞中，多数mtDNA编码亚基（包括复合体I的ND亚基、复合体IV的MTCO1/MTCO2、复合体V的ATP6/ATP8等）蛋白水平降低，而在OE细胞中升高。然而，这些蛋白的mRNA水平在KO细胞中反而升高，排除了转录受损的可能性。CAP脉冲追踪实验显示TMEM141不改变mtDNA编码蛋白的稳定性，但CAP冲洗恢复实验中MTCO2和ATP8的恢复速率在KO细胞中显著降低，在OE细胞中MTCO2恢复加速，表明TMEM141促进线粒体翻译。蔗糖密度梯度分析显示KO细胞中39S大亚基和55S完整核糖体轻度但可重复地减少。IP实验证实TMEM141与OXA1L（参与线粒体核糖体组装和膜蛋白插入的蛋白）互作，不过OXA1L蛋白水平不受TMEM141影响。值得注意的是，在siRNA敲低TMEM141的细胞中，虽未观察到MTCO1明显减少，但仍出现呼吸增强和复合体I装配增加，提示低水平TMEM141足以支持线粒体翻译但不足以抑制复合体I装配。
结果6：TMEM141缺失导致氧化损伤、mtDNA释放和cGAS-STING通路激活。 TMEM141 KO细胞中8-OHdG水平升高，表明氧化性DNA损伤增加。免疫染色显示大量TFAM信号位于线粒体外，qPCR确认胞质mtDNA含量升高。相应地，TBK1和IRF3磷酸化水平升高，STING蛋白表达增加，下游免疫基因（如*IFNB1*等）mRNA水平上调。回补TMEM141可恢复这些改变。在ρ⁰细胞（mtDNA缺失）中，TMEM141 KO不再激活cGAS-STING通路，证明该激活依赖于mtDNA释放。
结果7：果蝇dTMEM141的保守功能。 dTMEM141定位于线粒体。在果蝇肌肉中过表达dTMEM141降低ATP产生和氧化应激反应，并导致肌纤维和线粒体排列紊乱；老化果蝇中更为明显，超微结构分析显示线粒体嵴减少和肿胀。dTMEM141突变果蝇在肌肉中表现为ATP产生增加和ROS升高。在老化突变果蝇复眼中观察到小眼间大片空白区域，表明包裹感光细胞的胶质细胞丢失，基因组回补可挽救该表型。突变果蝇虽可存活、可育且寿命正常，但胶质细胞丧失表型提示TMEM141在维持神经胶质完整性中具有重要功能。
本研究首次鉴定TMEM141为线粒体复合体I装配的负调控因子，揭示了一种全新的OXPHOS适应机制。在基础（低能量需求）条件下，TMEM141通过与TIMMDC1结合限制复合体I装配，从而将呼吸和ROS产生维持在较低水平；在高能量需求（如半乳糖培养）条件下，线粒体蛋白酶AFG3L2和YME1L1降解TMEM141，解除对TIMMDC1的抑制，使复合体I装配增加，呼吸增强。这一发现打破了此前“所有复合体I装配因子均为正调控”的范式，为理解线粒体如何动态平衡能量供应与氧化应激提供了新的理论框架。
从应用价值看，TMEM141突变与人类智力障碍相关，果蝇模型中胶质细胞丧失的表型提示该蛋白可能在神经系统疾病中发挥作用。此外，TMEM141缺失引发的mtDNA释放和cGAS-STING通路激活将线粒体代谢调控与固有免疫联系起来，可能为理解线粒体功能障碍相关炎症性疾病的发病机制提供新线索。
第一，发现首个复合体I装配的负调控因子TMEM141；第二，揭示半乳糖通过促进AFG3L2/YME1L1与TMEM141的相互作用（而非上调蛋白酶表达）来降低TMEM141水平；第三，发现TMEM141在抑制复合体I装配的同时正向调节mtDNA编码蛋白翻译的“双重功能”；第四，将TMEM141缺失与mtDNA释放及cGAS-STING固有免疫通路激活联系起来；第五，在果蝇中验证了TMEM141的进化保守功能及其在胶质细胞完整性维持中的重要作用。
本研究还提示，半乳糖诱导的所有呼吸链复合体装配增加中，复合体I的调节部分依赖于TMEM141，但其他复合体（II–V）的调节机制仍有待阐明。此外，TMEM141对线粒体翻译的调控是否与其对复合体I装配的调控存在机制上的耦合，也是未来研究的重要方向。