本研究由来自法国巴黎巴斯德研究所（Institut Pasteur）基因组与遗传学部门及UMR3525实验室的Serge Gangloff、Stefania Francesconi、Adrien Villain、Samia Miled、Claire Denis和Benoit Arcangioli，以及来自多所法国研究机构联合实验室的Guillaume Achaz共同完成。其中Serge Gangloff和Guillaume Achaz为共同第一作者，Benoit Arcangioli为通讯作者。该研究于2017年12月18日发表在期刊《eLife》上。
一、学术背景
自发突变是遗传变异和生物进化的核心驱动力。在经典的遗传学框架中，突变率通常以“每代”或“每次细胞分裂”来表示，Luria与Delbrück的波动实验以及Lea与Coulson的后续工作奠定了这一领域的方法学基础。许多突变积累研究和直接测序研究均表明，复制依赖的突变谱以单核苷酸变异为主，插入/缺失相对较少，且普遍存在向AT碱基对偏移的替代偏好。然而，细胞生命并非仅由分裂构成。在自然界中，细胞经常进入静息期，即一种可逆的非分裂状态。静息状态下DNA复制基本停滞，因此复制依赖的突变来源大幅减少，但DNA损伤修复等过程仍可能产生新的突变。此前，“适应性突变”等概念已提示非分裂条件下也可能发生突变，但对于静息期独立于复制的突变速率和突变谱，以及这种突变对基因组演化的总体贡献，仍然缺乏系统性的实验表征。本研究以单细胞单倍体裂殖酵母为模式生物，旨在揭示静息期是否产生独特于生长期的突变力量，并刻画其定量特征与突变谱。
二、研究流程
研究首先建立了稳定均一的静息期细胞群体。作者使用原养型裂殖酵母菌株，在基本培养基中培养后，转入缺氮培养基诱导G1期阻滞和静息期进入。在转入之后的前两天内，细胞经历约两次分裂后停止增殖。通过显微镜统计不同天数中含隔膜的细胞比例，确认在静息期第1天之后，含隔膜细胞比例降至0.14%及以下，第4天之后进一步降至不足万分之一，从而证明群体中几乎不存在继续分裂或复制的细胞。
在短期突变积累实验中，作者将静息期培养物分别在第1、4、8、11和15天取样，涂布于含有5-氟乳清酸的丰富培养基平板上。5-氟乳清酸抗性表型能够特异性地指示ura4或ura5基因功能的丧失。作者对所有获得的抗性克隆进行DNA提取，并对ura4和ura5基因进行Sanger测序，以确定每个突变事件的具体类型、位置和序列变化。为了消除同一突变在克隆群体中被多次计数所造成的偏倚，作者将重复出现的冗余突变剔除，仅保留非冗余突变用于后续分析。同时，作者通过实验验证了ura4缺失型细胞在静息期两周内存活率与野生型无显著差异，从而排除了5-氟乳清酸抗性突变体在静息期受到显著选择优势的可能。
为了评估5-氟乳清酸药物本身是否在出静息期和再生长过程中影响突变谱，作者设计了一个对照实验：将静息6天的细胞分为两部分，一部分直接涂布在含药平板上，另一部分先经过一次分裂再涂布。所有得到的抗性克隆均进行测序。结果表明，无论是否经历一次分裂，突变均呈现静息期特征，说明药物选择对突变谱的干扰不显著。
此外，作者开发了基于最大似然框架的三种计算方法，用于从观察到的表型突变率推断总突变数。方法一利用氨基酸饱和分布估计关键氨基酸数量；方法二利用非同义单核苷酸变异位点的重复突变分布估计表型相关位点总数；方法三沿用Lang和Murray在2008年提出的方法，通过终止密码子的饱和程度来校正。三种方法分别估计ura4和ura5基因中能够导致表型的非同义突变比例，并据此外推全基因组突变率。
在长期实验中，作者将静息期延长至3个月，每两周更换一次培养基以维持营养条件并防止死亡细胞释放的氮源被存活细胞利用。作者设置了多个时间点测量细胞存活率，并在3个月后从存活群体中随机挑选243个克隆进行全基因组测序。测序采用Illumina HiSeq 2500平台，平均覆盖度超过50倍。变异检测使用GATK进行单核苷酸变异和短插入缺失的识别，同时结合SOAPindel、PRISM和Pindel三个专门检测插入缺失的工具，以提高灵敏度。所有候选变异均要求至少在40%的读段中出现，且局部覆盖度大于10倍。作者还通过Sanger测序验证部分变异，并估计了假发现率。此外，作者对384个静息1天的克隆、384个静息1个月的克隆、376个静息2个月的克隆和334个静息3个月的克隆进行了表型筛查，检测包括温度敏感性、高盐、细胞壁干扰剂、DNA复制抑制剂和去污剂等处理下的生长情况。
三、主要结果
在短期实验中，作者发现静息期第1天的突变谱与已发表的分裂期突变谱相似：单核苷酸变异占72%，插入缺失占28%，转换与颠换比约为1:2.18，AT偏倚为3.71。第1天的突变主要来源于进入静息期之前的最后几轮DNA复制，因此代表了生长期的突变特征。然而，随着静息期延长，突变谱发生显著变化。第8天和第15天的合并数据显示，单核苷酸变异比例下降至31%，而插入缺失比例上升至69%。插入缺失中缺失显著多于插入，缺失与插入的比值从第1天的0.7升高至第15天的4.7，净损失碱基达到1271个。同时，转换与颠换比降至1:3.7，AT偏倚降至1.58。这表明生长期普遍存在的向AT偏移趋势在静息期被削弱，甚至出现基因组碱基组成上的反向压力。通过对表型突变率的线性回归，作者得到静息期每天产生5-氟乳清酸抗性突变的频率为0.55×10⁻⁷，其中单核苷酸变异贡献0.14×10⁻⁷，插入缺失贡献0.41×10⁻⁷。经过计算校正后，估计全基因组每天产生约0.93×10⁻³个突变。
在长期实验中，细胞存活率呈现双相下降曲线，在前三周相对平缓，之后加速下降，3个月时存活率约为0.05%。对243个存活克隆的全基因组测序共鉴定出149个独特突变，包括72个单核苷酸变异和77个插入缺失，平均每个基因组0.61个突变。这一数值比短期实验外推值高出3.5至7倍，提示在长期静息过程中突变累积可能并非严格线性，或者存在其他因素加速突变。在77个插入缺失中，缺失27个，插入50个，净损失215个碱基。整体上，单核苷酸变异与插入缺失的比例接近1:1，与短期实验校正后的预测一致。同时，突变在237个无表型克隆基因组中的分布符合泊松分布，说明静息期突变力量均等地作用于所有基因组。对6个表现出表型的克隆进行全基因组测序，发现突变分别位于alg5、alg8、aur1、ccc2、gdi1和oca8基因，这些基因涉及细胞壁合成、膜泡运输和液泡功能等，可能在长期静息存活中提供选择优势。
四、结论与意义
本研究揭示了裂殖酵母在静息期积累突变的独特规律。作者将这种新的突变力量命名为“Chronos”，即希腊神话中时间的化身。Chronos的特征包括：单核苷酸变异与插入缺失的产生速率相当，缺失多于插入并导致基因组净损失，AT偏倚显著低于分裂期，且突变随静息时间持续累积。这一发现挑战了以往仅依赖每代突变率来理解基因组演化的框架，提出基因组大小和碱基组成受到生长期与静息期两种相反力量的交替塑造。从应用意义上讲，这一时间依赖性突变过程有助于完善分子钟模型，对于理解干细胞静息、衰老、癌症发生以及人类生殖系突变率的变异来源都具有重要意义。
五、研究亮点
本研究的创新之处在于：首次系统性地刻画了真核单细胞生物在静息期的突变谱，并将其与分裂期突变谱进行定量比较；建立了从表型突变率推断总突变率的多方法计算框架；结合短期表型筛选与长期全基因组测序，验证了静息期突变谱在全基因组水平上的普适性；发现了静息期对基因组大小和碱基组成施加与分裂期相反的选择压力。这些结果为理解非分裂细胞状态在遗传变异产生和进化中的作用提供了新的实验与理论依据。