本研究由Johannes Hahmann（亚琛工业大学技术及高分子化学研究所、DWI莱布尼茨交互材料研究所、马克斯·普朗克生命物质学校）、Boris N. Schüpp（马克斯·普朗克生命物质学校、海德堡大学跨学科科学计算中心、海德堡理论研究所）、Aman Ishaqat（亚琛工业大学技术及高分子化学研究所、DWI莱布尼茨交互材料研究所、慕尼黑工业大学药理学与毒理学研究所）、Arjuna Selvakumar（亚琛工业大学技术及高分子化学研究所、DWI莱布尼茨交互材料研究所）、Robert Göstl（亚琛工业大学技术及高分子化学研究所、DWI莱布尼茨交互材料研究所、伍珀塔尔大学化学生物学系）、Frauke Gräter（马克斯·普朗克生命物质学校、海德堡大学跨学科科学计算中心、海德堡理论研究所）以及Andreas Herrmann（亚琛工业大学技术及高分子化学研究所、DWI莱布尼茨交互材料研究所、马克斯·普朗克生命物质学校、通讯作者）共同合作完成。该研究于2025年4月10日发表在学术期刊 Chem 上（卷11，文章号102376）。
学术背景 本研究属于高分子机械化学（Polymer Mechanochemistry）与生物大分子物理化学的交叉领域。高分子机械化学旨在探究机械力如何引发聚合物内特定化学键的选择性断裂或化学反应，从而开发力响应材料，应用于应力传感、药物控释、自修复材料等领域。传统方法依赖于在聚合物链中嵌入人工合成的“力敏团”（Mechanophores），这些力敏团在受力时会发生特定的化学变化。然而，合成这些力敏团通常步骤繁琐，且对于断裂事件的精确分析（如断裂位点的单分子精度确定）在传统合成聚合物中极具挑战性。
DNA作为一种天然存在的、序列精确可控的生物大分子，为高分子科学提供了理想的模型系统。它具有单体序列、链长和分子量完全可控的特性，是研究序列控制聚合物（Sequence-Controlled Polymers, SCPs）基础问题的绝佳平台。本研究团队旨在利用DNA的这些特性，规避复杂的化学合成，探索一种无需力敏团即可实现高精度机械力诱导断裂的新策略。具体而言，他们关注双链DNA中的“缺口”（nick，即一条链上的单链断裂）是否能作为“力敏团类似物”，在超声波作用下引导互补链发生近乎核苷酸精度的断裂。研究目标包括：1) 验证超声波能否在缺口对面的DNA链上诱导产生精确的断裂分布；2) 阐明其背后的分子机制；3) 探索通过序列设计调控断裂精度和位置的可能性。
详细研究流程 本研究采用了实验与计算模拟相结合的方法，主要流程包括DNA样品设计与制备、超声波处理与初步表征、高通量测序数据分析、全原子分子动力学模拟验证与机制阐释，以及通过系统性的序列和长度变异来调控和验证断裂行为。
1. DNA样品设计与制备： 研究首先构建了特定长度的双链DNA（dsDNA）作为模型聚合物。核心模型是一个704碱基对（bp）的DNA片段（称为704）。利用一种能识别特定序列的切口内切酶（Nicking Endonuclease），在该704片段的中间位置（第352与353碱基之间）引入一个单链缺口，得到带缺口的DNA（称为704*）。选择中间位置是为了在超声处理过程中最大化统计平均的机械化学激活概率。此外，为了研究序列和长度的影响，还设计并制备了其他变体：改变缺口一侧30 bp序列的GC含量，得到高GC含量的gc*和全AT含量的at*；改变DNA总长度，得到400 bp的400*和1500 bp的1500；以及精细调控缺口两侧各4 bp序列的AT含量，得到一系列对称序列变体（atmi0 到 atmi4*）。还设计了包含偏位缺口（位于1500 bp片段的280/281位点）和双缺口（同时包含中心缺口和偏位缺口）的DNA结构，以研究断裂的位置效应和分级断裂行为。
2. 超声波处理与凝胶电泳初步表征： 将完整DNA（704）和带缺口DNA（704）等样品置于20 kHz的超声波下进行处理。通过琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）初步分析断裂产物。结果显示，完整DNA超声后产生一系列大小不一的弥散条带，表明断裂是随机、非选择性的。而带缺口的704 DNA超声后则产生一条清晰的、大小约为原DNA一半的条带，提示断裂可能主要发生在缺口对面，产生两个等长的352 bp片段。凝胶电泳也用于观察不同长度DNA（400, 704, 1500*）的表观断裂速率，以及验证偏位缺口和双缺口DNA的分级断裂现象。
3. 高通量测序（Next-Generation Sequencing, NGS）进行单核苷酸精度分析： 这是本研究的核心创新分析方法。为了以单核苷酸精度绘制断裂位点分布图，研究团队采用了Illumina测序技术。常规测序文库制备需要先将DNA随机片段化。在本实验中，超声波处理本身就完成了这一“片段化”步骤。关键挑战在于，超声断裂可能产生平末端、5‘突出或3’突出末端，而Illumina测序接头连接需要平末端。研究团队巧妙地利用了一个末端修复步骤：使用具有核酸外切酶和聚合酶活性的酶，将3‘突出端切除，将5’突出端补齐，从而将所有末端转化为平末端。重要的是，这个修复过程保留了原始断裂点的5‘端信息。随后进行接头连接和配对末端测序。通过对测序得到的读段与已知的参考序列（704*等）进行比对，可以重构每个DNA片段在参考序列上的起点和终点。对于缺口DNA，底部链（有缺口的链）的起点被固定于酶切缺口位置，而顶部链（完整链）的断裂点（称为位置j）则形成一个分布。通过统计所有片段顶部链断裂点j的频率，即可构建出断裂位点分布的直方图，并用高斯分布进行拟合，以均值（m，代表最可能的断裂位点）和标准差（s，代表断裂的精确度或分布宽度）来量化分析。
4. 全原子恒力分子动力学（All-Atom, Constant-Force Molecular Dynamics, MD）模拟： 为了从分子层面理解观察到的断裂分布机制，研究团队进行了全原子MD模拟。他们构建了带有缺口和不带缺口的dsDNA模型，并对其两端施加恒定的拉力（0.83 nN至3.0 nN范围）。模拟的关键发现是“ fraying ”（散开）现象：在拉力作用下，缺口对面的DNA双链会发生局部解链，暴露出一个单链DNA区域。他们通过监测互补碱基对之间的距离来量化散开程度，发现缺口DNA在缺口附近区域出现了显著的碱基对分离，而非缺口DNA则没有。进一步，他们计算了完整链骨架上的C3‘–O3’键（已知超声波断裂DNA的主要位点）所受的力。模拟结果显示，在缺口对面的散开区域，这些键所受的力显著升高，形成了一个力的平台区。这从力学角度解释了为什么断裂会集中在缺口对面的一个区域内，而不是一个精确的位点。
5. 系统性调控实验验证机制： 基于MD模拟提出的“散开控制断裂分布”假说，研究团队设计了一系列实验进行验证： * 改变GC含量： 比较gc*、704*和at*的断裂分布。结果发现，更稳定的GC富集序列（gc*）导致断裂分布更窄（s值减小21%），且分布中心（m）有微小但显著的偏移。MD模拟也证实，高GC含量区域的散开程度更低（6±3 nt），而低GC含量区域散开更宽（12±7 nt）。 * 改变DNA长度： 比较400*、704*和1500*。结果显示，较长的DNA链断裂更快（表观速率kapp更高），这与高分子机械化学中聚合度越高、链断裂越快的规律一致。然而，400*和704*的断裂分布宽度（s值）相近，而1500*的分布宽度显著增加（约35%）。这表明对于较短的DNA，缺口侧翼序列的杂交强度主导了散开程度和断裂精度；而对于更长的DNA，链中部可达到更高的力，导致更广泛的、非特异性的散开，从而加宽断裂分布。 * 精细调控单个核苷酸： 通过对称地逐步增加缺口两侧4 bp内的AT含量（atmi0*到atmi4*），发现断裂分布中心（m）基本不变，但分布宽度（s）随AT含量增加而线性显著增加。这证明了即使改变单个碱基对（影响氢键强度），也能系统性地调节散开程度，从而精细调控断裂分布的宽度。
主要结果 1. 超声波诱导DNA发生近核苷酸精度的断裂： 实验证实，在双链DNA中引入一个简单的缺口，可以作为有效的“力敏团类似物”。超声波处理能引导断裂主要发生在缺口对面的互补链上，产生高度集中的断裂产物（凝胶电泳显示单一清晰条带）。NGS分析揭示了断裂点以缺口对面位置为中心，呈正态分布，标准差约为±10个核苷酸，实现了“近核苷酸精度”的断裂控制。 2. 断裂分布由“散开”机制控制： MD模拟为实验观察提供了分子机制解释。拉力作用下，缺口对面的DNA发生局部熔解（散开），暴露出一个单链区域。该区域骨架键（如C3‘–O3’键）承受的机械力显著增高，成为断裂的优先位点。散开区域的大小直接决定了断裂分布的宽度。 3. 通过序列设计可编程调控断裂特性： 实验证明，改变缺口侧翼序列的碱基组成（GC/AT含量）可以预测性地调控断裂分布的中心位置（m）和宽度（s）。更稳定的GC对能限制散开，使断裂更精确、分布更窄；而不稳定的AT对则促进散开，加宽分布。甚至通过逐个核苷酸改变序列，也能线性地调节分布宽度。这实现了对DNA机械化学响应的“编程”。 4. DNA长度影响断裂动力学和分布： 较长的DNA链断裂更快，符合聚合物力化学的一般规律。但当链长超过一定范围（如1500 bp），由于链中部力场增强可能导致更广泛的散开和非特异性断裂因素介入，断裂分布会变宽，且中心可能发生偏移。 5. 复杂断裂行为的实现： 研究展示了将缺口置于非中心位置（偏位缺口）时，超声波仍能引发特定位置的断裂。更重要的是，在一条DNA链上引入两个缺口（一个中心，一个偏位）时，超声波处理会引发分级断裂：首先在中心缺口处断裂，产生两个主要片段；随着超声时间延长，含有第二个缺口的较长片段会进一步在第二个缺口处断裂。这模拟了合成聚合物中难以实现的多力敏团分级激活行为。
结论与意义 本研究成功证明，无需合成复杂的力敏团，仅利用DNA序列中精心设计的单链缺口，即可在超声波作用下实现双链DNA近乎核苷酸精度的选择性机械断裂。其分子机制在于力诱导的局部双链“散开”，使得暴露的单链区域成为力集中和断裂发生的热点。通过改变缺口侧翼的核苷酸序列，可以像编程一样精确调控断裂的位置和分布宽度。
科学价值： 1. 提供了研究聚合物机械化学的简化模型系统： DNA作为一种序列精确、单分散的天然聚合物，规避了合成力敏团聚合物的复杂化学步骤，为研究力化学中的基本问题（如力分布、链动力学、断裂竞争等）提供了一个强大、可编程的平台。 2. 引入了革命性的高精度分析工具： 将高通量测序技术应用于机械断裂分析，实现了对断裂事件的单核苷酸精度、高通量统计，突破了传统方法（如凝胶渗透色谱、核磁共振末端分析）分辨率低、信息量有限的瓶颈。 3. 深化了对力诱导生物大分子结构变化的理解： 将光学镊子研究中观察到的DNA“散开”现象，与流动场（超声波）下的共价键断裂联系起来，建立了从纳米尺度结构变化到宏观化学响应的清晰关联。
应用潜力： 1. 先进材料设计： 为设计新型力响应材料提供了新思路。例如，在DNA折纸（DNA origami）等纳米结构中，存在大量天然缺口。本研究方法可用于高通量分析这些结构的机械稳定性弱点（通过绘制断裂热点图），从而指导设计更稳定的结构。或者，有意在特定位置保留缺口，可实现外力触发的可控结构重排或功能释放（如酶释放）。 2. 力传感与生物技术： 基于序列可调的断裂灵敏度，可以开发新型DNA力传感器，用于测量细胞或材料内部的力学信号。 3. 药物递送与声药理学： 进一步拓展了利用超声波精准激活或释放DNA偶联药物的策略，通过序列设计可以实现更可控、更智能的释放动力学。
研究亮点 1. 方法创新性： 首创了“DNA作为序列定义模型聚合物 + 超声波处理 + 高通量测序分析”的研究范式，实现了对聚合物机械断裂事件前所未有的单分子精度解析。 2. 机制阐释深度： 通过巧妙的实验设计（系统改变序列和长度）与全原子分子动力学模拟紧密结合，不仅观察到了现象，而且深入揭示了其背后的物理化学机制——“散开”控制断裂分布，并验证了该机制的可编程性。 3. 概念突破： 提出了“无外加力敏团”（Mechanophore-Free）的机械化学策略，利用DNA自身结构特性（缺口）作为力集中点，简化了力响应系统的构建。 4. 技术通用性： 所建立的NGS数据分析流程和MD模拟方法具有通用性，可广泛应用于研究其他序列定义聚合物的力化学行为，或分析复杂DNA纳米结构的机械弱点。
其他有价值内容 研究还简要讨论了本方法相对于传统合成聚合物力化学分析工具（如凝胶渗透色谱、荧光读数）的优势，即高精度和高通量。它展望了该平台可用于研究环状与线形聚合物的断裂差异、侧链非共价相互作用对主链断裂的影响等基础问题。同时，也指出了未来可优化之处，例如进一步研究末端修复过程中聚合酶可能存在的序列特异性偏好对断裂分布分析的影响，以提升分析的准确性。