这篇由Michael E. Lee、William C. DeLoache、Bernardo Cervantes和John E. Dueber*（通讯作者）共同完成的研究论文，发表于2015年4月14日的《ACS Synthetic Biology》期刊上。作者们主要来自加州大学伯克利分校的生物工程系，同时隶属于加州大学伯克利分校与旧金山分校联合生物工程研究生项目、加州定量生物科学研究所（QB3）以及劳伦斯伯克利国家实验室物理生物科学部。该研究题为“一种高度表征的模块化、多部件组装酵母工具包”，为合成生物学领域，特别是在酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）这一重要宿主中，提供了一个系统性的工程化平台。
研究的学术背景植根于合成生物学的快速发展。合成生物学旨在通过工程化改造生命系统，实现新能源、农业、人类健康等领域的突破。其核心原则包括“抽象化”——将复杂生物系统分解为功能可预测的标准化部件（Parts），以及“快速原型构建”——通过高度并行化的实验迭代来探索广阔的参数空间。虽然大肠杆菌长期以来是合成生物学的主要模型，但酿酒酵母凭借其强大的遗传工具、被深入研究的生物学背景以及在工业发酵中的悠久历史，正日益成为一个极具吸引力的宿主。然而，尽管存在大量关于酵母生物学的资源和文献，研究者要从中提取并组合所需的工具进行工程应用仍颇具挑战。当时，国际标准化生物部件注册库（Registry of Standard Biological Parts）也明显偏向于细菌系统。因此，该研究旨在填补这一空白，为酵母合成生物学创建一个集标准化组装方法和一系列基础性、经过表征的部件于一体的多功能工程平台，以简化和加速在酵母中的实验进程。
研究的工作流程详尽而系统，主要可分为以下几个核心部分：
首先，研究者定义并建立了一套专为酵母设计的、基于MoClo（模块化克隆）策略的标准化DNA组装方法。这是一个自下而上的分层构建策略，包含四个抽象层级：1) 部件（Parts）：最基本的DNA序列元素（如启动子、编码序列、终止子等），通过BsmBI酶组装到通用入门载体中，形成“部件质粒”。每种类型的部件质粒都有由Bsai酶切产生的特定上下游粘性末端（overhang），使得同类型部件可以完全互换。2) 表达盒（Cassettes）：通过Bsai酶将不同类型的部件质粒（例如，一个启动子、一个编码序列、一个终止子）一步组装成一个完整的转录单元，用于在酵母中表达单个基因，形成“表达盒质粒”。3) 多基因质粒（Multigene Plasmids）：表达盒质粒可以通过BsmBI酶进一步组装，形成能同时表达多个基因的“多基因质粒”。组装由特殊的“组装连接子”介导，其含有独特的BsmBI粘性末端来指定每个表达盒的顺序。每个组装阶段使用不同的抗生素抗性进行筛选（如氯霉素→氨苄青霉素→卡那霉素），以最大限度地减少背景。这套流程非常高效，利用现有部件库构建一个多基因质粒仅需2天。该方法的好处在于操作简单（无需PCR或纯化步骤）、组装效率极高（正确组装率可达97%）、兼容多种克隆技术，并且专门设计了用于染色体整合的线性化方案（通过NotI酶切）。
其次，研究团队创建并表征了一个包含96个部件的“入门套装”工具包。这些部件涵盖了启动子、终止子、荧光蛋白、肽段标签、筛选标记、复制起点、染色体整合位点以及基因组编辑工具等。为了使这个工具包具有实际指导意义，作者对这些关键部件进行了系统性的功能表征。
在启动子表征方面，他们测试了19个组成型启动子、2个交配型特异性启动子和2个诱导型启动子。通过将启动子与荧光报告基因（mRuby2, Venus, mTurquoise2）连接，并在微孔板读数仪上测量批量荧光强度，他们量化了这些启动子的相对强度。结果显示，19个组成型启动子的强度跨越了近3个数量级，并且其强度在不同下游编码序列间保持一致，这与细菌系统不同。交配型特异性启动子（Pmfa1，Pmfα2）在正确的单倍体交配型中表现出6-10倍的诱导，而在错误的交配型或二倍体中几乎无活性。诱导型启动子中，Pgal1在存在半乳糖时能实现高达100倍的诱导，而Pcup1在硫酸铜诱导下可实现55倍诱导，但存在一定的本底表达。这些数据为研究者根据所需表达水平选择启动子提供了依据。
在终止子表征方面，他们选择了6个高表达基因下游的225 bp序列作为终止子，并与3种荧光蛋白和3种启动子进行组合测试。结果显示，对于给定的启动子-编码序列组合，不同终止子造成的表达差异最大为3.6倍，这表明在所选的这组终止子中，其对表达水平的影响相对温和，但仍有调节空间，尤其在需要精细调控时，建议对特定的启动子-终止子配对进行表征。
此外，研究还表征了三种N端蛋白降解标签（Ubiquitin tags: Ubi-M弱，Ubi-Y中，Ubi-R强），通过将其融合到mRuby2蛋白的N端，并利用不同强度的启动子进行表达，证明了这些标签可以有效地调整细胞内目标蛋白的稳态水平，为调控蛋白浓度提供了除转录调控外的另一条途径。
研究的核心成果之一是深入比较了不同拷贝数系统（单拷贝染色体整合、低拷贝CEN6/ARS4质粒、高拷贝2微米质粒）对基因表达的影响。他们构建了表达两种荧光蛋白（mRuby2和Venus）的菌株，测试了所有9种启动子强度组合，并分别考察了两个基因位于同一载体/位点或不同载体/位点的情况。批量荧光测量结果显示：随着拷贝数增加，平均表达水平通常升高；但对于最强启动子（Ptdh3），高拷贝质粒相比低拷贝质粒带来的表达提升很小，表明细胞内的表达机制可能成为限制因素。更有启发性的是单细胞水平的流式细胞术分析：1) 变异性：与染色体整合相比，质粒系统（无论是低拷贝还是高拷贝）都引入了更大的细胞间表达变异，表明质粒拷贝数在细胞群体中并不严格一致。2) 相关性：当两个基因位于同一个染色体位点或同一个质粒上时，它们的表达在单细胞水平高度相关（数据点沿对角线分布），这暗示拷贝数是引入变异的主要来源。然而，当两个基因位于两个独立的质粒上时，这种相关性就消失了，说明两个质粒在同一个细胞内的拷贝数是相互独立、不相关的。基于这些结果，作者强烈建议：在可能的情况下优先使用染色体整合；若需要更高表达，应优先使用低拷贝质粒，并且所有基因应组装在同一个质粒上，而不是分散在多个质粒上。这一结论对实验设计具有重要指导意义。
为了促进染色体整合的广泛应用，研究者开发并比较了两种基于核酸酶切割的高效整合方法。他们在染色体上构建了一个含有I-SceI酶切位点（同时包含CRISPR/Cas9引导RNA靶向序列）的“着陆垫”。通过将修复DNA（含有待整合的表达盒）与能瞬时表达切割酶（I-SceI或Cas9/sgRNA）的“切割质粒”共转化酵母，他们发现切割可显著刺激同源重组效率。特别是，若在转化前将表达切割酶的DNA线性化，效率可进一步提升。其中，使用线性化的I-SceI表达DNA时，整合效率甚至比常规质粒转化效率高出1.8倍，且脱靶整合率极低（约0.02%）。这为高效构建大型染色体整合文库扫除了技术障碍。
最后，研究者展示了如何利用该工具包和CRISPR/Cas9系统进行高效、无标记的多重基因组编辑（CRISPRm方法）。他们设计了靶向四个内源基因（LEU2, HIS3, MET15, TRP1）的引导RNA和相应的修复DNA（引入提前终止密码子）。实验发现，当共转化Cas9/sgRNA质粒和修复DNA时，转化子数量比仅转化Cas9/sgRNA质粒（无修复DNA）高出100倍以上，表明Cas9造成的DNA双链断裂对细胞具有毒性，而修复DNA的存在通过同源重组修复移除了靶位点，从而解除了毒性。通过将多个sgRNA串联组装在同一个Cas9表达质粒上，他们成功实现了单次转化同时敲除两个、三个甚至四个基因，其中四重敲除的正确表型效率约为20%。这种方法避免了使用多个筛选标记或繁琐的交配步骤，极大简化了多重基因组修饰的流程。
本研究的主要结论是成功开发并交付了一个全面的酵母合成生物学工具包。该工具包的核心价值在于：1) 方法学创新：提供了一套标准化、模块化、高效的DNA组装流程（基于Golden Gate和MoClo），极大地加速了从设计到获得物理DNA的周期。2) 资源建设：提供了经过系统表征的基础生物部件（启动子、终止子、降解标签等）及其性能数据，为理性设计提供了依据。3) 关键见解：通过细致的比较实验，揭示了不同基因传递系统（染色体 vs. 质粒）对表达水平和变异性的深刻影响，并给出了明确的使用建议。4) 技术整合：无缝集成了高效染色体整合（利用I-SceI或CRISPR/Cas9）和无标记多重基因组编辑（CRISPRm）等先进工具，使染色体工程变得和质粒操作一样方便。
这项研究的亮点在于其高度的系统性和实用性。它不仅是一个“工具包”，更是一个包含“设计规则”的完整工程平台。其新颖性体现在将MoClo组装标准专门化并优化用于酵母，并对部件和系统性能进行了大规模、定量化的表征。这些工作为酵母合成生物学研究提供了急需的标准化框架和共享资源，有望促进不同实验室之间材料和数据的直接交流与比较，提升研究的可重复性，并使研究人员能够从繁琐的技术细节中解放出来，更多地专注于更高层次的实验设计。正如作者所言，这项研究为建立一个分享新部件、追求更高一致性和可重复性的酵母工程社区奠定了坚实的基础。