本文档属于类型a，即报告了一项原创研究。以下是针对该研究的学术报告：
本研究的主要作者包括Ingrid Lea Karlskås、Kristina Maudal、Lars Axelsson、Ida Rud、Vincent G. H. Eijsink和Geir Mathiesen。他们分别来自挪威生命科学大学（Norwegian University of Life Sciences）和挪威食品、渔业与水产研究所（Nofima）。该研究于2014年3月10日发表在《PLOS ONE》期刊上。
该研究的主要科学领域是乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）的异源蛋白分泌。乳酸菌在食品工业中广泛应用，并因其“一般认为安全”（Generally Regarded as Safe, GRAS）状态而被用作益生菌和酶及代谢产物的生产者。近年来，乳酸菌还被研究作为在胃肠道中递送抗原和其他医学相关蛋白的潜在载体。然而，乳酸菌属成员之间的功能差异较大，因此需要开发适用于多种乳酸菌的蛋白表达和分泌工具。本研究的目标是分析PSIP表达系统在乳酸菌中的适用性，特别是针对除植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）外的其他乳酸菌的异源蛋白分泌。
PSIP系统的基本功能测试
研究首先使用包含广宿主范围复制子（broad-host-range replicon）SH71rep的PSIP411载体，测试其在14种乳酸菌中的诱导基因表达功能。结果显示，在10种乳酸菌中，诱导基因表达系统是有效的。
PSIP分泌载体的改造
基于上述结果，研究团队将三种PSIP载体中的窄宿主范围复制子（narrow-host-range replicon）256rep替换为SH71rep，并将这些改造后的载体转入五种不同的乳酸菌中。这些载体分别携带了来自植物乳杆菌的不同信号肽（signal peptides, SPs）：LP_3050、LP_0373和LP_2578。
异源蛋白分泌实验
研究团队使用改造后的载体在这些乳酸菌中分泌目标蛋白——金黄色葡萄球菌核酸酶A（Staphylococcus aureus nuclease A, NucA）。通过SDS-PAGE和Western blot分析，评估了不同信号肽在分泌效率和蛋白产量上的差异。
生长曲线分析
研究还分析了NucA生产和分泌对乳酸菌生长速率的影响，比较了诱导和非诱导条件下的生长曲线。
质粒拷贝数分析
通过实时定量PCR（qPCR）技术，研究团队测定了不同载体在乳酸菌中的质粒拷贝数（plasmid copy number, PCN），并分析了其与蛋白分泌效率的关系。
PSIP系统的广宿主范围适用性
PSIP411载体在10种乳酸菌中成功实现了诱导基因表达，表明SH71rep复制子具有广宿主范围特性。
信号肽的分泌效率差异
在五种乳酸菌中，LP_3050信号肽通常导致最高水平的NucA分泌，而LP_2578信号肽的分泌效率较低。不同乳酸菌对信号肽的响应存在显著差异，例如在加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）中，LP_0373和LP_2578信号肽未能驱动NucA分泌。
生长曲线分析结果
除了加氏乳杆菌外，其他乳酸菌在诱导条件下的生长速率与非诱导条件相似，表明NucA的生产和分泌对这些菌株的生长影响较小。
质粒拷贝数与蛋白分泌的关系
替换为SH71rep复制子后，质粒拷贝数显著增加，尤其是在植物乳杆菌中，质粒拷贝数增加了近五倍。质粒拷贝数的增加与NucA分泌量的增加呈正相关，但分泌效率还受到宿主转录、翻译和转运能力的影响。
本研究成功改造了PSIP分泌载体，使其适用于多种乳酸菌，并验证了植物乳杆菌信号肽在其他乳酸菌中的功能。研究结果表明，LP_3050和LP_0373信号肽在多种乳酸菌中表现出较高的分泌效率，为乳酸菌的遗传工程提供了重要工具。这些改造后的载体可用于开发乳酸菌作为生物技术和治疗相关蛋白的递送载体，例如作为活疫苗载体或益生菌功能优化。
广宿主范围载体的开发
通过替换复制子，研究团队成功扩展了PSIP系统的宿主范围，使其适用于多种乳酸菌。
信号肽功能的多物种验证
首次在多种乳酸菌中验证了植物乳杆菌信号肽的功能，揭示了信号肽在异源蛋白分泌中的物种特异性。
质粒拷贝数与分泌效率的关系
研究通过qPCR技术揭示了质粒拷贝数对异源蛋白分泌效率的影响，为优化蛋白表达提供了新思路。
研究还探讨了分泌压力对乳酸菌生长的影响，特别是在加氏乳杆菌中，NucA的生产和分泌导致了明显的生长抑制。这一发现提示，在开发乳酸菌作为蛋白生产平台时，需要综合考虑宿主的耐受性和分泌能力。
总体而言，本研究为乳酸菌的遗传工程和异源蛋白分泌提供了重要的实验工具和理论依据，具有显著的科研和应用价值。