本研究由复旦大学、浙江亚热带作物研究所等机构的研究人员张佳琪、欧阳晟、蔡星星、杨晟、陈秋夏、杨骥、宋志平、张文举、王宇国、朱艳*和南蓬*共同完成，成果以题为“Phenotypic adaptation and genomic variation of Kandelia obovata associated with its northern introduction along southeastern coast of China”的原创研究论文形式，于2025年3月26日发表在开放获取期刊 Frontiers in Plant Science 上。
研究的学术背景聚焦于植物进化生物学与全球气候变化响应领域。随着全球气候变化加剧，理解生物如何适应环境波动成为关键科学问题。植物适应性是其生存能力的决定性因素。红树林作为热带、亚热带潮间带的关键乔木生态系统，以其高生物多样性和强大的碳封存能力著称，并在防风消浪、保护海岸线方面扮演着不可或缺的角色。然而，红树林也是受气候变化影响最脆弱的类群之一，其地理分布主要受温度限制。因此，红树林植物成为研究植物对全球气候变化快速响应的理想对象。秋茄（Kandelia obovata） 是红树科植物，在中国分布广泛，以其耐寒性和在高纬度生存的能力而闻名，常被用于引种和栽培研究。自2003年和2005年起，秋茄从福建漳州的九龙江口红树林自然保护区分别被引种至福建泉州的泉州湾和浙江温州的鳌江河口。经过约20年，这两个引种种群在表型上已观察到显著差异。本研究旨在探究这些差异是否与遗传背景相关，并通过同质园实验（Common Garden Experiment, CGE） 和全基因组重测序（Whole-Genome Resequencing, WGRS） 技术，解析秋茄在向北引种过程中的表型适应性、遗传变异模式、种群遗传结构以及环境适应（特别是低温适应）的潜在遗传机制。研究的目标是：（1）比较泉州（QZ）和温州（WZ）种群在同质环境下的表型、叶片功能性状及越冬存活率差异；（2）评估不同地理种群（包括海南东寨港DZG、福建漳州ZZ、福建泉州QZ和浙江温州WZ）的遗传多样性和亲缘关系；（3）识别WZ种群在适应北部环境过程中受到强烈选择的基因组区域和候选基因；（4）整合基因组和转录组数据，探索秋茄快速适应环境变化的分子基础。该研究对于理解红树林的环境适应特性、指导其保护、可持续发展和新品种选育具有重要意义。
详细的工作流程包含两个主要部分：同质园实验与表型分析以及全基因组重测序与生物信息学分析。
第一部分：同质园实验与表型分析 1. 材料收集与实验设置：于2019年5月，分别从福建泉州湾洛阳江红树林自然保护区和浙江温州鳌江河口红树林采集了约20,000株秋茄胚轴，移植至上海南汇东滩（121.97°E, 30.90°N）的塑料盆中进行同质园栽培，以评估其在自然条件下的越冬存活率。随后于2021年5月，再次从QZ和WZ两地采集成熟胚轴。首先随机测量了各30株健康胚轴的胚轴长度（HL）、重量（HW）和直径（HD）。然后，从每个种群中挑选出1000株重量、长度和大小相近的个体，同样移植至上海进行同质园栽培，用于后续表型观测。 2. 形态性状测定：同质园生长18个月后，从QZ和WZ种群中各随机选取30株健壮植株，测量其株高（PH）、基径（BD）、冠幅（W）、叶片数（LN）和分枝数（BN）。并从两个种群的上部枝条各采集30片完整叶片，测量鲜重（LFW）、饱和鲜重（LSFW），利用ImageJ软件分析扫描图像，获取叶长（LL）、叶宽（LW）、叶周长（LP）、叶面积（LA）、叶形指数（LSI）等参数。将叶片恒温烘干至恒重后称取干重（DW），计算相对含水量（RWC）、叶片干物质含量（LDMC）和比叶面积（SLA）。 3. 叶片解剖结构与气孔特征评估：采用番红-固绿染色法制备秋茄叶片石蜡切片，使用ImageJ软件量化叶片厚度（LT）、上/下角质层厚度（UCU/LCU）、上/下表皮厚度（UEP/LEP）、上/下皮下层厚度（UHY/LHY）、上/下栅栏组织厚度（UPT/LPT）、海绵组织厚度（ST）等指标，并计算栅海比（P/S）、细胞紧密度（CTR）和疏松度（SR）。采用指甲油印迹法制作叶片下表皮气孔临时装片，在光学显微镜下观察并利用ImageJ统计视野内的气孔数量（SN）、气孔面积（SA）和气孔密度（SD）。 4. 抗寒性测定：记录上海南汇东滩基地2020年和2021年最冷月份的日最低温度变化。在2020年1月21日（无极端低温）和2021年1月5日（寒潮期间）分别记录两个种群秋茄植株在自然环境下的越冬存活率。使用非配对学生t检验比较不同种群各指标值的差异显著性，使用卡方检验（Yates连续性校正）评估不同温度条件下WZ和QZ种群越冬存活率的差异。
第二部分：全基因组重测序与生物信息学分析 1. 样本采集与测序：于2023年7月中下旬，从四个地点采集成熟秋茄叶片样本：海南海口东寨港红树林自然保护区（DZG，10株）、福建漳州九龙江口红树林省级自然保护区（ZZ，10株）、福建泉州湾洛阳江红树林自然保护区（QZ，10株）以及浙江温州鳌江河口红树林（WZ，10株），共计40个样本。使用CTAB法提取DNA，构建Illumina测序文库，在上海迈瑞博生物医药科技有限公司的Illumina NovaSeq系统上进行双末端测序。 2. 变异检测与注释：使用fastp软件对原始测序数据进行质控。使用BWA-MEME软件将高质量读数比对到秋茄参考基因组上。使用Samtools排序，Sentieon Genomics工具流程进行PCR重复标记、碱基质量重校准和变异检测（SNP）。使用SnpEff对变异进行注释。随后使用VCFtools进行严格过滤，去除等位基因数大于2、平均深度小于4、次要等位基因频率小于0.05、基因分型率低于70%的SNP。使用Plink软件对用于种群结构分析的SNP进行连锁不平衡（LD）修剪。 3. 遗传多样性、亲缘关系与种群结构分析：基于过滤后的VCF文件，使用Stacks软件计算观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和核苷酸多样性（π）。使用GenAlEx软件计算多态信息含量（PIC）和香农指数，以评估四个种群的遗传多样性水平。使用Stacks计算种群间的遗传分化指数（FST）。使用IQ-TREE2软件基于最大似然法构建系统发育树。使用Admixture软件进行无监督的最大似然聚类分析，确定最佳祖先簇数（K值）并展示遗传结构。使用Plink进行基于SNP的主成分分析（PCA）以可视化样本间的遗传关系。 4. 选择性清除扫描与正选择基因鉴定：采用滑动窗口策略（窗口大小10 Mb，步长10 kb），使用Pixy软件计算QZ和WZ种群间的FST和π值。为加强正选择分析，进行了1000次排列检验，通过随机打乱种群标签并重新计算每个10 kb窗口的FST分布，以模拟无选择压力下的随机分化，并将排列分布的第95百分位数作为基准。最终，将FST值处于前5%的基因组区域确定为QZ和WZ种群间的潜在候选分化区域。此外，结合FST和π比值（πQZ/πWZ）进行选择性清除分析，将FST处于前5%且π比值极高的区域视为WZ种群受到强烈选择扫描的潜在区域。使用TBtools将选定区域与候选基因关联，获得WZ种群的正选择基因。对鉴定出的区域进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（Kegg）富集分析。 5. 启动子顺式作用元件分析与多组学整合：使用TBtools提取WZ种群正选择基因转录起始位点上游2000 bp的序列，通过PlantCARE数据库进行启动子顺式作用元件分析。整合研究团队先前生成的转录组数据，将冷胁迫下两个种群的差异表达基因（DEGs）与基于基因组FST和π值鉴定出的40个候选正选择基因取交集。对这些基因的转录组表达谱和启动子元件进行进一步分析，并使用R语言和TBtools进行可视化。
本研究的主要结果如下： 1. 两个秋茄种群的形态与叶片功能性状差异：在同质园中，WZ种群的胚轴生理参数（HL, HW, HD）以及植株的PH, BD, LN, BN, W均显著低于QZ种群。在叶片功能性状方面，WZ种群的SLA显著大于QZ，而DW显著更低。叶片解剖结构显示，QZ种群的LT、ST和SR显著更大，而WZ种群的UHY、UPT、P/S和CTR显著更厚或更高。气孔特征方面，QZ种群具有显著更小的SA和更高的SD。这些结果表明，来自较高纬度（WZ）的种群表现出“生长缓慢、防御增强”的策略，具有更高的组织密度和结构紧实度（如更高的P/S和CTR），这可能有助于增强抗寒性；而来自较低纬度（QZ）的种群则倾向于将更多资源分配给生长和繁殖。 2. 两个秋茄种群越冬存活率的差异：在无极端低温的2020年冬季，WZ和QZ种群的越冬存活率分别为84.5%和67.3%。在经历极端低温的2021年冬季，两种群存活率均下降，但WZ种群（18.6%）仍显著高于QZ种群（6.8%）。卡方检验表明，无论在何种温度条件下，WZ种群的越冬存活率都显著高于QZ种群，证实了WZ种群具有更强的耐寒性，更能适应北部的同质园环境。 3. 全基因组重测序数据概况与遗传多样性分析：对40个样本进行WGRS，平均测序深度为12.20×，基因组覆盖率为90.14%。共鉴定出117,774个高质量SNP。遗传多样性分析显示，四个种群的遗传多样性水平随纬度升高而降低：DZG最高，其次为QZ和ZZ（两者水平相近），WZ最低。同时，ZZ、QZ和WZ种群的观测杂合度（Ho）均高于期望杂合度（He），提示在向北引种过程中可能存在奠基者效应和瓶颈效应。 4. 种群亲缘关系与遗传结构：系统发育树、PCA和遗传结构（Admixture）分析结果高度一致：DZG作为外类群明显分开；ZZ和QZ种群紧密聚在一起，遗传分化极低（FST = 0.034）；而WZ种群则与ZZ/QZ种群明显分离，存在中等程度的遗传分化（FST ~ 0.1）。这表明，尽管引种时间仅约20年，WZ种群已经与源种群（ZZ）及其同期的另一引种种群（QZ）产生了显著的遗传分化。 5. 选择性清除扫描与WZ种群正选择基因鉴定：通过扫描QZ和WZ种群间基因组分化信号（top 5% FST），共鉴定出1159个候选基因。KEGG富集分析显示这些基因在“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”、“谷胱甘肽代谢”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”等与胁迫响应相关的通路上显著富集。进一步结合FST和π比值分析，在WZ种群中鉴定出13个受到强烈正选择的基因组区域，包含40个正选择基因。GO富集分析表明这些基因显著富集于“胁迫响应”、“解剖结构发育”、“有性生殖”等生物过程。 6. 正选择基因的启动子顺式作用元件特征：对40个WZ正选择基因的启动子序列分析发现，其含有大量与非生物胁迫响应相关的顺式作用元件，特别是低温响应元件（LTR）、脱落酸响应元件（ABRE） 以及茉莉酸响应元件（CGTCA-motif, TGACG-motif）。此外，还广泛存在与水杨酸、乙烯、损伤响应等相关的元件。这暗示了这些基因可能通过ABA和JA等激素信号途径参与对低温胁迫的响应调控。 7. 基因组与转录组数据整合分析：将基因组选择性清除分析鉴定的1159个基因与冷胁迫下两个种群的3810个差异表达基因取交集，得到215个共同基因。对这些基因的SNP变异进行分析，发现了包括启动子区、内含子区以及错义突变在内的多种变异。特别值得注意的是，在部分基因的启动子区，QZ和WZ种群之间存在关键碱基差异，导致WZ种群特有的胁迫响应元件（如STRE、ABRE、MYB结合位点等）出现。例如，在编码干旱诱导蛋白的基因中，WZ种群特有的一个ABRE元件可能增强其bZIP转录因子结合能力，从而在冷条件下上调表达。这些启动子区的序列变异可能是导致两种群在冷胁迫下目标基因转录水平差异、进而影响植株耐寒性的原因之一。
本研究的结论是：通过对秋茄向北引种过程中形成的不同种群（QZ和WZ）进行同质园实验和全基因组重测序分析，揭示了秋茄在约20年时间内表现出的快速适应能力。研究发现：（1）表型上，WZ种群采取了与QZ种群不同的“生长-防御”权衡策略，表现为生长减缓、叶片结构更紧密（栅栏组织更厚、栅海比更高），这与其更强的越冬存活率相符，是适应北部较冷环境的表现。（2）遗传上，尽管引种时间不长，但最北端的WZ种群已与源种群（ZZ）及另一引种种群（QZ）产生了中等程度的遗传分化，且其遗传多样性最低，这可能源于引种过程中的奠基者效应和瓶颈效应，随后在低温自然选择压力下加速了遗传优化。（3）基因组选择性清除分析表明，温度（特别是低温）是驱动秋茄种群遗传分化的主要环境因子。WZ种群中受到正选择的基因富含与低温、ABA和JA激素响应相关的顺式作用元件，揭示了其通过调控胁迫响应和激素信号通路来适应低温环境的潜在分子机制。（4）多组学整合分析发现了可能与耐寒性相关的启动子区关键变异，为理解表型差异的遗传基础提供了线索。
本研究的意义与价值在于：科学价值：为理解植物（特别是长寿木本植物）在短时间尺度上的快速适应性进化提供了新的证据；揭示了红树林植物响应环境变化（尤其是温度）的表型可塑性与遗传分化协同作用的早期模式；展示了结合同质园实验、群体基因组学和转录组学在解析物种环境适应机制方面的强大能力。应用价值：研究结果为秋茄乃至其他红树植物种质资源的鉴定与利用提供了重要的遗传数据支持；阐明的耐寒相关性状和候选基因为红树林抗逆新品种（如耐寒品种）的选育提供了理论基础和分子靶点；对于指导中国乃至全球红树林的保护、恢复、北移引种及可持续管理具有重要的实践意义。
本研究的亮点包括：重要发现：首次在约20年的时间尺度上，同时从表型适应和基因组变异层面，实证了红树植物秋茄在人工引种背景下的快速遗传分化与适应；明确了最北端引种种群遗传多样性降低但耐寒性增强的现象，并解析了其潜在的“生长-防御”权衡策略和分子适应机制。方法新颖性：创新性地将经典的同质园实验与现代群体基因组学（全基因组重测序、选择性清除扫描）、转录组学及生物信息学分析深度整合，系统、多维度地揭示了引种适应的全貌。特别在分析中采用了排列检验来强化选择性清除信号的可信度，并对正选择基因的启动子变异进行了细致的功能关联分析。研究对象的特殊性：以具有重要生态功能且对气候变化敏感的红树林关键物种秋茄为研究对象，聚焦于其在中国东南海岸由南向北的人工引种这一独特生态学过程，研究结论兼具理论深度和现实紧迫性。
其他有价值的内容包括：研究明确了低温是限制秋茄分布及驱动其种群分化的首要气候因子，这与其他生态学研究结果相互印证。同时，研究也指出，虽然温度梯度与纬度变化强相关，但未来的研究需要收集盐度、降水、土壤等多层环境数据，以更全面地分析影响秋茄遗传结构和分布的环境因素复合效应。此外，研究中观测到的高观测杂合度现象，为进一步研究引种过程中的种群动态（如奠基者效应、人工选择）提供了切入点。