本研究报告由南开大学生命科学学院刘硕、赵子润、纪雨欣、朱航琦以及天津农业大学的孙英峰、李明春和余启林*共同完成，并于2026年发表在微生物组学领域的学术期刊 Microbiome 上（卷14，第7期）。该研究属于合成生物学与农业微生物学的交叉领域，聚焦于如何利用工程化手段解决固氮菌在豆科植物根际定殖效率低下的难题。
学术背景与目的： 氮素是植物生长不可或缺的关键营养元素。传统化学氮肥的过度使用带来了严重的地下水污染等环境问题。因此，利用生物固氮为作物提供氮源被视为一种绿色、可持续的农业策略。固氮菌能够将空气中的氮气转化为植物可利用的氮素。豆科植物（如紫云英、苜蓿）与根瘤菌等固氮菌形成的共生固氮体系尤为重要，它们能显著提升土壤肥力，常被用作绿肥或饲料。理论上，向土壤中接种外源固氮菌可以增强生物固氮作用，但在实践中，这些外源菌的活性常因其在植物根部的定殖能力低、易被土著微生物排斥而大打折扣。因此，如何有效增强固氮菌在根部的定殖和持久性，是当前农业微生物应用面临的一大挑战。随着合成生物学技术的发展，对根际微生物组进行理性调控成为可能。本研究团队先前构建了一株能够展示人工多糖识别蛋白CMC的合成细菌EccMC。该细菌能像“桥梁”一样，通过结合植物根系表面的多糖，增强功能微生物与根系的物理接触，从而重塑根际微生物组以强化植物修复。本研究旨在探索这一合成细菌策略能否应用于农业领域，通过促进外源固氮菌在豆科植物根部的定殖，重塑根际微生物组，最终达到提高土壤肥力和植物产量的目的。
详细研究流程： 本研究采用了从微观机制验证到宏观效应评估的系统性实验流程，主要研究对象为两种典型豆科植物：紫云英和苜蓿。
1. 菌株构建与验证： 研究使用的核心工具是两株合成大肠杆菌：实验组EccMC和对照组EcM。EccMC表达表面展示的多糖结合蛋白CMC（包含来自热纤梭菌CipC的葡聚糖结合域CBM和荧光蛋白mCherry），而EcM仅表达mCherry，不具多糖结合能力。这两种菌株的构建方法基于团队先前的研究，通过将合成基因克隆到pET-28a质粒中，再转化至大肠杆菌BL21获得。此外，研究从野豌豆根际土壤中分离了两株自生固氮菌作为外源功能菌：中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae NKN632）和鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas endophytica NKN643）。同时，从桃树根际分离了两株不产胞外多糖的细菌作为阴性对照。
在实验开始前，研究首先通过一系列结合实验验证了EccMC的功能。共聚焦显微镜观察结合荧光染色（FITC-ConA标记多糖，DAPI标记细菌）证实，固氮菌NKN632和NKN643表面富含多糖，而对照菌则不含。更重要的是，EccMC能强烈结合从固氮菌表面提取并标记的荧光多糖（FITC-NFB PS），而EcM不能，证明CMC蛋白能特异性识别固氮菌的多糖。进一步的细胞互作实验显示，EccMC能与固氮菌细胞发生共聚集，而EcM与固氮菌则随机分散，这从微观上证明了EccMC作为“桥梁”连接固氮菌的潜力。
2. 根际定殖能力评估： 此环节旨在验证EccMC在活体植物根际促进固氮菌定殖的能力。以紫云英为模型植物，将其根系分别与以下处理共孵育：PBS对照、固氮菌+EcM、固氮菌+EccMC。通过共聚焦显微镜直接观察和菌落形成单位（CFU）计数法定量分析。结果显示，在固氮菌+EccMC处理组中，根系表面同时出现了代表固氮菌（蓝色，DAPI）和EccMC（红色，mCherry）的强烈荧光，且两者与根系自身多糖信号（绿色，FITC-ConA）高度共定位，表明细菌在根系表面形成了密集的类生物膜结构。CFU计数进一步量化了结果：固氮菌+EccMC组有超过90%的固氮菌结合到了根系上，而固氮菌+EcM组则低于20%。延长共培养时间至48小时后，扫描电镜观察清晰显示，只有固氮菌+EccMC组的根系表面吸附了大量细菌细胞。这些证据链条完整地证明了EccMC能显著增强外源固氮菌在豆科植物根系的招募与定殖。
3. 根际微生物组重塑分析： 在验证定殖能力的基础上，研究进入盆栽实验阶段，评估EccMC与固氮菌共同接种对根际生态的长期影响。将紫云英幼苗种植于无菌土壤中，在第14天分别接种：PBS（对照）、固氮菌+EcM、固氮菌+EccMC。培养28天后，收集根际土壤样品。使用磁珠法提取总微生物DNA，分别用细菌16S rRNA基因V3-V4区引物和真菌ITS区引物构建文库，进行高通量测序，以分析细菌和真菌群落结构。 测序数据分析揭示了EccMC的显著调控作用。α多样性分析显示，固氮菌+EccMC处理提高了根际真菌群落的辛普森指数。更为关键的是，群落组成分析发现，固氮菌+EccMC处理显著提高了根际土壤中与固氮相关的细菌类群的相对丰度，如根瘤菌目（Rhizobiales，增加0.494倍）和鞘氨醇单胞菌目（Sphingomonadales，增加0.345倍）。同时，能够形成生物膜的细菌（包括上述类群和黄单胞菌目）总丰度在该处理组中也最高。CFU计数也证实，该处理组根际土壤中可培养的固氮菌数量最多。真菌群落分析则显示，与固氮相关的 Pleosporales 目真菌的相对丰度在固氮菌+EccMC组中提升了1.87倍。这些数据共同表明，EccMC的引入不仅直接促进了接种的外源固氮菌定殖，还重塑了整个根际微生物群落结构，使其向更有利于固氮和植物生长的方向演变。
4. 代谢组学与土壤肥力测定： 为了探究微生物组变化背后的代谢机制及其对土壤功能的影响，研究进行了非靶向代谢组学分析和一系列土壤生化指标测定。 代谢组学分析采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术。主成分分析显示，固氮菌+EccMC组与对照组代谢物谱存在显著差异。火山图分析鉴定出该组中有438种代谢物相较于对照组显著上调。京都基因与基因组百科全书通路富集分析指出，差异代谢物显著富集在α-亚麻酸代谢、组氨酸代谢、嘌呤代谢等与氮代谢和植物生长相关的通路上。 土壤生化指标测定了生物固氮效率和肥力水平的关键参数。乙炔还原法测定固氮酶活性显示，固氮菌+EccMC组的活性（16.2 nmol/min/g）显著高于对照组（~11.0 nmol/min/g）和固氮菌+EcM组（~11.3 nmol/min/g）。凯氏定氮法测得该组土壤全氮含量最高（414 mg/kg vs. 对照组217 mg/kg）。化学需氧量法测定的土壤有机质含量也在该组达到峰值（23.6 mg/kg）。此外，代表土壤健康度的关键酶活性——脲酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性，在固氮菌+EccMC处理下均得到显著提升。这些数据从代谢功能和土壤化学性质层面证实，EccMC辅助的固氮菌定殖有效增强了根际的氮转化能力和整体土壤肥力。
5. 植物生长表型评估： 研究的最终落脚点是评估上述微生物和土壤层面的积极变化是否转化为可观的农艺学效益。研究对紫云英的生长指标进行了全面测量。 组织学切片显示，固氮菌+EccMC组的根系细胞损伤最少。该组植物的根系更长（11.25 cm）、更粗（直径0.344 mm），且根系干重中的氮、磷、钾含量最高。地上部分的表现同样突出：植株高度（17.6 cm）、鲜重（2.46 g）和叶面积（34 cm²）均显著优于其他处理组。叶片叶绿素a和b含量、可溶性蛋白含量以及干叶中的氮磷钾含量也以该组为最高。扫描电镜观察发现该组叶片表面突起结构更致密。为了验证该策略的普适性，研究在另一种重要豆科绿肥植物苜蓿上重复了关键实验，得到了高度一致的结果：EccMC同样促进了固氮菌在苜蓿根系的定殖、重塑了微生物组（提升了根瘤菌目、鞘氨醇单胞菌目和Pleosporales的相对丰度）、显著提高了土壤固氮酶活性、全氮和有机质含量，并最终大幅提升了苜蓿的株高和鲜重。
主要结论与价值： 本研究成功开发了一种合成细菌辅助的外源固氮菌定殖新技术。其核心结论是：利用展示人工多糖结合蛋白CMC的合成细菌EccMC作为“分子桥梁”，可以高效促进外源固氮菌在豆科植物根系的招募与定殖。这种增强的定殖作用进而重塑了根际微生物组，提高了有益固氮微生物（如根瘤菌目、鞘氨醇单胞菌目）和相关真菌的相对丰度。重塑后的微生物组通过提升固氮代谢途径活性和土壤关键酶活性，显著增强了生物固氮效率和土壤肥力（表现为固氮酶活性、全氮和有机质含量上升），最终将这些生物学效益转化为豆科植物生长和产量的显著提高。该策略在紫云英和苜蓿两种植物上均验证有效，展示了其潜在的应用广度。
研究的亮点与意义： 本研究的亮点在于其鲜明的创新性和系统性：第一，方法创新：将原本用于环境修复的合成生物学工具（EccMC）创造性地应用于农业增产领域，为解决固氮菌根际定殖效率低这一经典难题提供了全新的“工程化桥梁”思路。第二，机制清晰：研究从微观结合（细菌-细菌、细菌-根系）、中观群落（微生物组测序）、宏观代谢（代谢组学）到最终表型（土壤肥力、植物生长）构建了完整且逻辑严密的数据链条，层层递进地阐明了从“引入合成菌”到“提高作物产量”的作用机理。第三，应用潜力明确：研究不仅证明了概念，更在两种经济作物上验证了效果，为减少农业对化学氮肥的依赖、发展绿色可持续农业提供了一项具有实操前景的合成生物学策略。该策略的核心元件——多糖结合蛋白，未来或可发展为一种通用工具，用于招募其他有益微生物（如解磷菌、生防菌），从而在促进植物生长、增强作物抗逆性、土壤修复等多个方面发挥更广泛的作用。
其他有价值内容： 研究中还特别指出，EccMC作为外源工程菌，在接种14天后即无法检测到，这暗示了其生态风险较低，为其实际应用的安全性提供了一线有利证据。此外，论文补充材料中包含了丰富的支持性数据图（如单独接种固氮菌效果有限、多糖染色验证、各种统计分析验证图等），进一步夯实了研究结论的可靠性。