学术报告

研究的作者和期刊信息

这项研究的主要作者是 Alex P. Seabright, Nicholas H.F. Fine, Jonathan P. Barlow, 等（Total 16位作者），主要作者所在的研究机构包括英国伯明翰大学（University of Birmingham）的 School of Sport, Exercise and Rehabilitation Sciences、Institute of Metabolism and Systems Research，以及澳大利亚新南威尔士大学悉尼校区（UNSW Sydney）等。本研究发表在 *The FASEB Journal*，论文标题为“AMPK activation induces mitophagy and promotes mitochondrial fission while activating TBK1 in a PINK1-Parkin independent manner”，论文接收时间为 2020年2月28日。

研究学术背景

本研究属于线粒体质量控制领域，重点研究一种重要的细胞过程——线粒体自噬（mitophagy），该过程旨在通过清除受损线粒体以维持细胞能量代谢的稳定性。尽管多种分子机制已被提议参与调控线粒体自噬，特别是 PINK1-Parkin 信号通路，其功能和作用方式在已知的实验室条件下得到了广泛研究。然而，目前对于骨骼肌细胞中线粒体自噬的内部机制的认知仍然有限。

线粒体自噬对衰老肌肉的肌肉质量下降（sarcopenia）具有重要意义。从线粒体膜去极化到自噬体靶向受损线粒体的过程涉及多种信号级联，包括但不限于 PINK1、Parkin 和自噬受体（如 optineurin [OPTN], Nuclear Dot Protein 52 [NDP52]）。然而，有研究表明，在缺乏 PINK1 的情况下线粒体自噬仍然可以在骨骼肌内发生。这表明，除 PINK1-Parkin 外，其他信号途径可能在骨骼肌内起到更重要的作用。

因此，这项研究的目的在于探讨骨骼肌细胞线粒体自噬的内源性分子机制，尤其是 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）的作用以及是否与 PINK1-Parkin 协作。

研究的详细流程与实验设计

1. 建立研究模型与实验设计： 研究使用小鼠骨骼肌C2C12成肌细胞（myoblast），并通过稳定表达荧光自噬检测报告基因（mCherry-GFP-MTFIS1[101-152]，缩写为“mito-QC”）构建模型细胞系。这一报告基因可通过观察荧光信号（GFP信号酸性环境下逐渐消退）直接量化线粒体自噬的水平。

2. CCCP（碳氰化合物）处理诱导线粒体去极化与AMPK激活： 为了研究线粒体去极化如何影响线粒体自噬，实验中使用了碳氰化物 m-氯苯肼（CCCP, 10 μM）处理细胞。实验组分别经历了6小时、12小时、24小时的CCCP处理。对照组使用DMSO处理。

为进一步验证 AMPK 的作用，研究使用了 AMP 激活蛋白激酶特定的小分子激活剂 991，并对其剂量（10 μM 和 20 μM）以及处理时间（1小时、2小时）进行了试验。

1. Western blot检测关键分子变化： 为研究信号通路的活跃性与互相关联性，利用 Western blot 检测了以下分子标志物：

   • PINK1-Parkin信号相关蛋白：例如p-Ser65-Ubiquitin（UB激酶活性检测）。
   • AMPK信号相关蛋白：例如MFF（线粒体分裂因子，Mitochondrial Fission Factor）和ULK1 。
   • 自噬相关激酶与受体：如 TBK1（Tank-binding kinase 1）和 OPTN。

2. 线粒体形态变化与自噬量化： 使用带自动聚焦的荧光显微镜对“mito-QC”信号进行了成像。在CCCP诱导自噬过程中，量化mCherry、GFP信号变化及线粒体分裂参数（如直径和圆形度）。

3. UB Pull-down 内源性泛素化检测： 使用Halo-tagged Polyubiquitination Binding Tube 检测泛素化蛋白变化，深入研究 PINK1 激活对线粒体蛋白如 CISD1 的具体作用。

4. AMPK功能研究： 为了探究 AMPK 依赖性，特别使用了 CRISPR-Cas9 基因敲除技术构建 AMPK α1/α2 双敲除的 Hek293 细胞系。

研究主要结果

1. CCCP处理刺激线粒体分裂与线粒体自噬： CCCP处理导致荧光信号比（mCherry/GFP）增加18%，表明线粒体自噬被诱导。同时观察到线粒体形态由延长变为更碎片化（形态圆形度增加）。

2. PINK1-Parkin通路功能性确认： 使用泛素捕获技术，检测到 CCCP处理后会上调p-Ser65-Ubiquitin以及 CISD1 泛素化，表明PINK1及Parkin依赖的信号在骨骼肌中是活跃的。但有趣的是激活的时间延迟需6小时以上。

3. TBK1独立于PINK1-Parkin信号被激活： TBK1的磷酸化（p-Ser172）在CCCP处理初期即上调且与时间呈正相关。在Pink1敲除的HeLa细胞中，仍检测到TBK1活跃性，表明TBK1激活是PINK1-Parkin非依赖性的。

4. AMPK直接驱动线粒体分裂和自噬： AMPK通过直接磷酸化MFF（Ser146）促进线粒体分裂，进一步刺激线粒体自噬。在AMPK α1/α2缺失的Hek293细胞中，MFF磷酸化显著减少。

5. AMPK促进TBK1信号活跃： AMPK 活化剂 991 处理后 TBK1 活性显著增强，而这一过程独立于PINK1-Parkin信号。此外，观察到 AMPK 激活也促进了ULK1的磷酸化，表明 TBK1 可能通过 ULK1 来调控。

研究结论与意义

本研究证明了骨骼肌细胞中的线粒体自噬不仅依赖于 PINK1-Parkin 信号，还具有 AMPK 调节的独立通路。AMPK通过调控线粒体分裂因子MFF和实现TBK1磷酸化增强了线粒体自噬能力，充分说明了AMPK作为细胞能量感知器在清除受损线粒体中发挥的重要作用。

此外，本研究还提出 TBK1 的活性与 PINK1-Parkin 通路无关，提示了一种潜在未探明的线粒体自噬激活机制。这一发现对加深我们对线粒体动力学和自噬调控机制的理解具有重要意义，并可能为衰老相关疾病的干预提供理论支持。

研究亮点

1. 提供了直接测量骨骼肌细胞线粒体自噬的方法，构建了稳定表达的“mito-QC”肌细胞系。
2. 揭示了AMPK通过独立于PINK1-Parkin的途径，调控TBK1以促进线粒体自噬的新机制。
3. 使用UB Pull-down技术首次在骨骼肌内明确展示PINK1和Parkin信号的内源性作用。

研究局限与展望

未来研究可进一步探讨TBK1活化的确切分子机制，以及验证该机制在衰老肌肉或其他高代谢组织中的适用性。尤其在运动诱导线粒体自噬中，结合电刺激实验无疑可以验证运动态下AMPK信号功能。