大卫·贝克（David Baker，霍华德·休斯医学研究所，华盛顿大学蛋白质设计研究所）、安东尼·P·格林（Anthony P. Green，曼彻斯特大学曼彻斯特生物技术研究所）和因德雷克·卡尔维特（Indrek Kalvet）、玛丽·奥特迈尔（Mary Ortmayer）、赵静明（Jingming Zhao）等人联合在《Journal of the American Chemical Society》上发表了一项突破性研究。该研究通过从头设计蛋白质（de novo protein design）的方法，成功构建了一类具有可调控底物结合口袋（tunable substrate binding pocket）和开放金属配位位点（open metal coordination site）的血红素酶（heme enzymes），为定制化生物催化剂的开发提供了全新的平台。
研究背景与目标 血红素蛋白在自然界中承担着氧气运输、电子传递和催化等多种功能。其中，细胞色素P450（cytochrome P450s）等酶的核心结构特征在于其含有五配位铁（pentacoordinated iron）的辅因子（cofactor），并且该金属位点紧邻一个开放的底物结合口袋，这使得它们能够催化极其多样的化学反应。然而，早期的蛋白质从头设计大多局限于结构较为简单的螺旋束（helical bundle）支架。这种简单的支架虽然能够结合卟啉（porphyrin），却无法支持类似于P450那样的大型、开放且可定制的活性位点口袋，并且常表现出构象灵活性，难以进行理性工程改造。因此，该研究的核心目标是将P450卓越的催化几何结构与从头蛋白质设计近乎无限的定制能力相结合，创造出一种高亲和力的血红素结合蛋白，该蛋白需要具备几个关键特性：一个大型的中心空腔，其内壁由众多可重构的侧链构成，用于结合多样化的底物；极高的热稳定性，使得活性位点的优化不依赖于蛋白质的整体折叠；以及模块化的骨架结构，便于重构活性位点而不破坏整体结构。
研究方法与工作流程 为了实现这一目标，研究团队选择了一种闭合的α-螺旋螺线管重复蛋白（closed α-helical solenoid repeat protein）架构，具体为一种环形（toroidal）支架，作为设计的起点。这种蛋白具有超高的稳定性，其中心空腔由重复结构单元的内侧链围成，稳定性由重复单元间的疏水堆积决定，因此空腔内的残基几乎可以完全重构。
设计工作主要分为以下几个步骤。首先，研究人员使用Rosetta Match算法，将一个由组氨酸（histidine）配位的血红素模型放置于环形支架的中心孔道中。该血红素模型在铁原子的远端结合了一个甲基，作为空间占位符以确保为未来底物留出体积，并在部分计算中引入一个谷氨酸或天冬氨酸侧链以增加预组织性。接着，利用Rosetta组合设计计算，对血红素结合位点周边的氨基酸序列和构象进行优化，以增强对血红素辅因子的结合能力。设计模型根据组氨酸与铁的相互作用几何结构、形状互补性和血红素结合口袋的预组织程度进行评估。之后，对具有理想特征的设计进行了配体对接计算以验证结合取向。最终，从二十二个被选中的设计方案中鉴定出一个名为dnhem1的蛋白质。
dnhem1在大肠杆菌中成功表达，通过紫外/可见光谱（UV/vis spectroscopy）和圆二色光谱（circular dichroism, CD）进行表征。其血红素解离常数小于10 nM，表明其具有极高亲和力。CD光谱显示，其熔解温度超过95 °C，具有超高的热稳定性，且其血红素结合能力在95 °C下依然得以保持。关键的1.6埃分辨率X射线晶体结构（X-ray crystal structure）显示，dnhem1的结构与计算设计模型高度吻合，骨架均方根偏差仅为1.18埃。该结构证实了组氨酸（His148）对血红素铁的配位，以及一个外源咪唑分子占据了开放的远端配位点，验证了设计目标已成功实现。
研究进一步展示了dnhem1的工程改造潜力，主要分为两个方向。第一个方向是工程化过氧化物酶（peroxidase）活性。以Amplex Red为底物，dnhem1本身已展现出过氧化物酶催化活性。通过两轮定向进化（directed evolution），对血红素结合空腔的残基进行随机突变和DNA改组（DNA shuffling），获得了两个三重突变体dnhem1.2和dnhem1.2b。dnhem1.2的催化效率显著提升，而dnhem1.2b则稳定了一个类似于天然过氧化物酶的中性铁酰基（ferryl, Fe(IV)=O）中间体。
第二个方向是计算设计对映体互补的卡宾转移酶（carbene transferases）。研究团队选择苯乙烯与重氮乙酸乙酯的环丙烷化（cyclopropanation）反应作为模型。他们首先使用密度泛函理论（DFT）计算了生成S,S和R,R对映体的反应过渡态模型，然后将这些模型与dnhem1的血红素辅因子叠合，最后利用Rosetta FastDesign软件对远端口袋的14个残基进行重新设计，以分别容纳和稳定不同的过渡态几何结构。通过计算设计获得的蛋白质变体均表现出极高的非对映选择性，且S,S选择性设计取得了高达97.5:2.5的对映体比例，R,R选择性设计也达到了最高93:7的对映体比例。其中，最优的S,S选择性变体dnhem1-ss19在制备规模的反应中，仅需0.02摩尔百分比的催化剂用量，即可以93%的分离产率获得光学富集产品，并实现了高达5000次的催化转化数，其性能优于许多未经进化的原始设计酶。
研究结论与价值 该研究成功实现了预设的设计目标：创造了一个在开放金属配位点旁拥有大型可重构结合口袋的高亲和力血红素结合蛋白。其科学价值在于，它首次将从头蛋白质设计从简单的螺旋束支架拓展到具有大型可定制空腔的复杂环形结构，为研究金属酶的结构-功能关系提供了强大的模型系统。应用价值方面，dnhem1的高热稳定性和模块化结构，使其成为开发工业级生物催化剂的理想起点。通过定向进化增强过氧化物酶活性，以及通过计算设计实现对卡宾转移反应对映选择性的精确控制，充分证明了该系统易于工程化的特性，为创建能催化更广泛化学反应的超稳定人工金属酶铺平了道路。
研究亮点 本研究的亮点主要体现在以下几个方面。第一是设计概念的重大突破，成功地将蛋白质从头设计的控制能力与天然P450酶的关键催化几何特征相结合。第二是结构验证的高度精确性，1.6埃的X射线晶体结构与设计模型几乎完美匹配，证明了计算设计方法的可靠性。第三是功能的快速极化和多元化，不仅通过少数几轮定向进化获得了高效的过氧化物酶，还通过纯计算设计创造了对映体互补的卡宾转移酶，实现了对产物立体化学的完全控制，这在仅经过计算设计、未经实验进化的酶中是极为罕见的。最后，该研究建立的模块化、超稳定的血红素蛋白支架，为未来整合非天然辅因子或进一步重构结合口袋以适应更复杂的底物，开辟了广阔的前景。