本研究由华南理工大学医学院第二附属医院检验医学科的蔡东洋、王逸凡、张子怡等学者，联合香港科技大学化学系吴宏开教授团队共同完成。通讯作者为刘大宇。该研究于2025年2月12日在线发表于*Biosensors and Bioelectronics*期刊第276卷，论文编号117256。本研究属于生物传感器与生物电子学领域，聚焦于数字微流控技术与CRISPR诊断技术的交叉创新。

研究背景与目的

重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a联合检测在资源有限环境下的病原体即时检测中展现出巨大潜力。然而，由于RPA体系与CRISPR/Cas12a体系之间存在化学不兼容性，Cas12a核酸酶会在RPA扩增过程中持续降解模板、扩增子及引物，导致检测灵敏度下降和检测时间延迟。这一缺陷使得传统RPA-CRISPR/Cas12a方法难以实现直接定量检测。已有的解决方案包括空间分隔法、相分离法以及光控crRNA法等，但这些策略难以应用于数字CRISPR检测所需的大规模微小分区体系。另一种策略是设计无PAM（前间隔序列邻近基序）的crRNA以识别RPA链置换后产生的单链DNA，但该方法存在靶点位置限制、优化机制不明确及与其他等温扩增方法不兼容等局限性。因此，本研究旨在开发一种能够从原理层面解决RPA与CRISPR/Cas12a不兼容问题的数字检测方法，实现对病原体核酸的快速、精准绝对定量。

研究流程与实验设计

本研究开发了一种名为“droplet pairing-merging enabled digital RPA-CRISPR/Cas12a assay”（简称DIMERIC）的检测方法。其核心创新在于利用具有“葫芦形”微孔阵列的微流控芯片，实现大体积RPA液滴与小体积CRISPR/Cas12a液滴的顺序性、尺寸选择性捕获，形成一对一的液滴配对，从而在空间上分离两种反应体系。待RPA反应完成后，通过电场诱导液滴融合，激活CRISPR/Cas12a系统进行检测。这种时空分离策略从根本上消除了Cas12a对RPA反应的抑制作用。

具体实验流程分为以下步骤：首先，利用Y形微通道液滴发生器将含DNA模板的RPA反应预混液与醋酸镁引发剂在油相中即时混合并乳化，生成直径约130微米的大体积RPA液滴，有效避免了RPA在分区前的过早扩增。同时，利用流式聚焦结构生成直径约80微米的小体积CRISPR/Cas12a液滴，其中Cas12a、crRNA及荧光报告探针的浓度按5.3倍浓缩配置。随后，将RPA液滴乳液加入微孔阵列芯片，通过浮力作用使液滴上浮并捕获于大孔中；再加入CRISPR/Cas12a液滴乳液，使其捕获于小孔中，形成一对一的液滴配对。芯片在37摄氏度下孵育15分钟进行RPA反应。反应完成后，使用压电点火器在芯片上表面施加电场，诱导配对液滴融合。融合后，CRISPR/Cas12a各组分浓度恢复至1倍工作浓度。随后在37摄氏度下孵育5分钟，使Cas12a对被激活后产生的非特异性切割活性充分裂解单链DNA荧光报告探针。最后，利用倒置荧光显微镜对液滴阵列进行成像，通过Alexa Fluor 647染料标记所有液滴以确定液滴位置和总数，再根据FAM通道荧光信号判定阳性液滴和阴性液滴。

在方法优化方面，本研究系统考察了荧光报告探针浓度、反应温度和切割时间等关键参数。实验表明，报告探针浓度在250–2000 nM范围内，阳性液滴比例保持不变，但信噪比随浓度增大而提高；综合考虑信噪比与成本，选择1000 nM作为最佳浓度。在37、39和42摄氏度三个温度条件下，阳性液滴比例和荧光强度无显著差异，最终选择37摄氏度作为反应温度。切割动力学实验显示，阳性液滴比例在切割5分钟后即达到平台期，延长至25分钟无显著变化，因此确定总检测时间为20分钟（15分钟RPA+5分钟切割）。

主要实验结果

在液滴生成质量方面，RPA液滴平均直径为129.8微米（变异系数1.83%），CRISPR/Cas12a液滴平均直径为80.1微米（变异系数1.72%），液滴单分散性优良。在液滴捕获与配对效率方面，大体积液滴捕获效率为99.5%，小体积液滴捕获效率为98.6%，有效配对效率为98.1%，配对后液滴融合效率为98.6%，且RPA反应过程中未观察到非特异性液滴融合现象。

在定量性能评估中，以5倍梯度稀释的乙型肝炎病毒DNA样本为检测对象，阳性液滴比例随模板浓度降低而成比例下降，无模板对照实验中未出现假阳性液滴。实测DNA浓度与稀释倍数之间呈现优异的线性相关性（R² = 0.99893）。与商品化数字PCR系统（DropXpert S6）的对比结果显示，DIMERIC检测值与数字PCR检测值高度一致，但数值略低于数字PCR，这一轻微低估可归因于RPA反应中酶介导的DNA熔解与引物退火过程易受发夹结构、引物二聚体及核酸结合蛋白等因素干扰。

在临床验证阶段，本研究收集了广州市第一人民医院24例疑似HBV感染患者的血清样本，分别采用实时荧光定量PCR、数字PCR和DIMERIC方法进行平行检测。结果显示，16例阳性样本在三种方法中均被一致检出，8例阴性样本均未产生信号。DIMERIC与数字PCR的定量相关性（R² = 0.97337）优于其与实时荧光定量PCR的相关性（R² = 0.92033）。这一差异主要归因于实时荧光定量PCR依赖标准曲线而产生较高不确定性、临床样本经多次冻融后浓度可能发生变化，以及院内实时荧光定量PCR与本研究所用数字PCR和DIMERIC共享同一套DNA提取物但实时荧光定量PCR使用了另一套提取试剂盒。

研究结论与意义

本研究成功开发了DIMERIC检测方法，通过液滴配对-融合策略实现了RPA与CRISPR/Cas12a体系的时空分离，从根本上解决了二者不兼容的问题。该方法将总检测时间缩短至20分钟，同时兼具数字检测的绝对定量能力和CRISPR检测的高特异性。与已有数字RPA-CRISPR/Cas12a方法相比，DIMERIC不依赖无PAM crRNA设计，不受靶点位置限制，且具有与LAMP、RCA、NASBA等多种等温扩增方法及Cas9、Cas13、Cas14等多种CRISPR效应酶联用的潜力。该方法在HBV DNA临床样本定量检测中表现出与数字PCR高度一致的准确性，为病原体核酸的快速精准定量提供了有价值的工具。

研究亮点与创新性

本研究的核心创新在于：第一，利用葫芦形微孔阵列芯片实现了不同尺寸液滴的顺序性、尺寸选择性捕获与一对一配对，有效避免了同类液滴之间的无效配对问题，这是对已有对称八字形微孔结构的实质性改进；第二，通过空间-时间双重分离策略彻底消除了CRISPR/Cas12a对RPA反应的抑制作用，无需对crRNA进行特殊设计或对反应体系进行复杂优化；第三，采用Y形微通道液滴发生器将醋酸镁引发剂与RPA预混液在乳化瞬间混合，有效消除了数字RPA检测中常见的过早扩增问题；第四，整个检测流程仅需20分钟，显著快于已有数字RPA-CRISPR/Cas12a方法。此外，研究团队还指出，未来可通过整合光学元件与成像模块开发全集成设备，并将课题组此前开发的液滴编码策略与DIMERIC结合，以实现高阶多重数字CRISPR检测。