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该研究的主要作者包括Cheng-yan Mou、Lu Zhang、Han Zhao、Zhi-peng Huang、Yuan-liang Duan、Zhong-meng Zhao、Hong-yu Ke、Jun Du、Qiang Li和Jian Zhou。研究机构为四川省农业科学院水产研究所。该研究于2023年10月16日发表在《Frontiers in Immunology》期刊上。
该研究属于免疫学和鱼类生物学领域，重点关注鱼类皮肤细胞对病原体感染的免疫反应。Aeromonas hydrophila（嗜水气单胞菌）是一种广泛分布于水生环境中的革兰氏阴性机会性病原体，能够感染多种淡水鱼类，导致皮肤溃疡和出血性败血症，造成严重的经济损失。鱼类皮肤作为天然屏障，在抵御环境压力和病原体感染中起着关键作用。然而，由于鱼类皮肤的功能多样性和复杂的细胞组成，解析其免疫反应机制具有挑战性。该研究旨在通过单核RNA测序（single-nuclei RNA sequencing, snRNA-seq）技术，揭示中国长吻鮠（Leiocassis longirostris）皮肤细胞在A. hydrophila感染后的免疫反应机制。
研究主要包括以下几个步骤：
鱼类与细菌感染
从四川省农业科学院水产研究所获取成年中国长吻鮠，分为感染组和对照组。感染组鱼浸泡在含有10^6 CFU A. hydrophila的水中30分钟，对照组鱼不做处理。48小时后，采集皮肤样本进行snRNA-seq分析。
单核细胞捕获与cDNA扩增
从感染组和对照组鱼的皮肤组织中分离细胞核，使用10x Genomics的Chromium控制器进行单核捕获，并通过PCR扩增cDNA，构建测序文库。
单核RNA测序
使用Illumina 10x Genomics平台进行测序，获得原始数据后，通过bcl2fastq软件转换为fastq文件，并与中国长吻鮠基因组序列比对。使用CellRanger软件进行基因计数和数据分析。
数据质量控制与初步分析
对原始数据进行过滤和校正，获得19,581个单核细胞的转录组数据（对照组10,400个，感染组9,181个）。通过UMAP降维和无监督聚类，识别出33个细胞簇，并基于已知标记基因将其分类为12种细胞类型。
细胞类型鉴定与功能分析
鉴定出8种角质形成细胞（KC）、4种成纤维细胞（FB）、2种内皮细胞（EC）、8种免疫细胞等。对感染后显著扩张的KC1、KC2和KC5细胞簇进行差异表达基因（DEGs）分析，并通过KEGG通路富集分析其功能。
免疫细胞分析
比较感染组和对照组中免疫细胞的比例，发现中性粒细胞在感染组中显著增加。对中性粒细胞的DEGs进行KEGG通路富集分析，揭示其在A. hydrophila感染中的潜在作用。
细胞类型鉴定
研究成功鉴定了12种细胞类型，包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞等。其中，KC1、KC2和KC5在感染后显著扩张，分别与环境信号传导、内分泌功能和代谢相关。
差异表达基因与通路分析
KC1的DEGs主要富集在Hippo信号通路、MAPK信号通路等与环境信号传导相关的通路；KC2的DEGs主要富集在内分泌系统相关的通路；KC5的DEGs主要富集在代谢相关通路。中性粒细胞的DEGs显著富集在IL-17信号通路和白细胞跨内皮迁移通路，表明其在A. hydrophila感染中发挥重要作用。
免疫反应机制
研究表明，A. hydrophila感染导致皮肤角质形成细胞增殖和分化异常，同时触发中性粒细胞的炎症反应。中性粒细胞通过IL-17信号通路和白细胞跨内皮迁移通路参与抗菌免疫反应。
该研究首次绘制了中国长吻鮠皮肤细胞的全面图谱，揭示了A. hydrophila感染后皮肤细胞的免疫反应机制。研究结果表明，中性粒细胞在抵御A. hydrophila感染中发挥关键作用。该研究为深入理解鱼类皮肤免疫反应提供了重要数据，并为鱼类细菌感染的防治提供了新的思路。
首次应用snRNA-seq技术分析鱼类皮肤细胞
该研究首次使用单核RNA测序技术，全面解析了鱼类皮肤细胞的转录组特征，为鱼类皮肤免疫研究提供了新的技术手段。
揭示中性粒细胞的关键作用
研究发现中性粒细胞在A. hydrophila感染中通过IL-17信号通路发挥重要作用，为鱼类抗菌免疫机制提供了新的见解。
全面的细胞类型鉴定
研究成功鉴定了12种皮肤细胞类型，并揭示了其在感染后的功能变化，为鱼类皮肤细胞的功能研究奠定了基础。
该研究还提供了详细的实验方法和数据分析流程，为其他研究者开展类似研究提供了参考。此外，研究数据已公开发布，可供进一步分析和验证。
通过这项研究，我们不仅深入了解了鱼类皮肤细胞的免疫反应机制，还为鱼类疾病的防治提供了重要的理论依据。