本研究由Shang-Lin Chang、Hsuan-Kai Wang、Luh Tung及Tien-Hsien Chang等人完成，主要作者隶属于中央研究院基因组学研究中心及台湾大学基因组与系统生物学学位学程。该研究发表于*Nature Ecology & Evolution*期刊，于2018年10月8日在线发表，文章标题为“Adaptive transcription-splicing resynchronization upon losing an essential splicing factor”。

研究背景与目的

必需基因（essential genes）传统上被定义为细胞生存所不可或缺的基因。然而，近年来的研究表明，基因的必需性实际上依赖于环境与遗传背景，是一种定量的而非二元的性状。例如，芽殖酵母中约9%的必需基因缺失可以通过适应性突变得到抑制；直系同源基因在不同物种进化过程中甚至可以呈现相反的必需性状态。基于这些观察，作者提出一个核心假设：必需基因的丢失并不一定会导致致命的后果，反而可能为基因组进化铺平道路。为了验证这一假设，研究团队选择在真核生物基因表达中处于转录与mRNA输出之间的关键步骤——前信使RNA剪接（pre-mRNA splicing）——作为研究体系。剪接过程由剪接体（spliceosome）完成，该机器包含U1、U2、U4、U5和U6五种小核核糖核蛋白颗粒（snRNPs）以及众多剪接因子。其中PRP28是一种必需的DEAD/H-box蛋白，其功能是在完全组装的剪接体上促使U1 snRNP从5′剪接位点解离，从而使U6 snRNP可以结合到该位点。此前研究已表明，在特定突变（如U1C-L13F，即U1C蛋白第13位亮氨酸变为苯丙氨酸）存在时，PRP28可以被删除，但细胞在低温下剪接效率严重受损，生长缓慢。

研究流程与实验设计

首先，研究团队以携带U1C-L13F遗传修饰且完全缺失PRP28的酵母菌株作为祖先菌株（ancestor），在20°C条件下进行约300代的实验进化，建立了10个独立进化品系。在初步筛选中，6个进化品系（ev1、ev3、ev6、ev7、ev8和ev9）在20°C的适应性显著提升，同时28°C下的适应性成本有限。遗传分析显示，ev3的适应性改良性状由单一基因座控制，而ev9由两个独立基因座控制。随后，研究团队对ev3和ev9进行了RNA测序（RNA-seq）和定量PCR分析，发现二者的剪接效率恢复到接近野生型（wild-type, WT）水平，且7个随机选择基因的内含子积累显著降低。

为了定位适应性突变，团队对祖先菌株、ev3和ev9进行了超过100倍覆盖度的全基因组测序。与祖先基因组相比，ev3基因组存在染色体结构重排，但基因本体分析未发现重复片段中特定基因类别的富集。在非同义单核苷酸多态性方面，ev3携带4个、ev9携带5个。连锁分析显示，ev3中U1C-R21C（在原有U1C-L13F基础上的额外改变）和PRP8-S521F与适应性性状共分离；ev9中LUC7-G20V和SPT7-Y418Stop（第418位酪氨酸变为终止密码子）与性状共分离。通过将显性等位基因逐一导入祖先菌株的单拷贝质粒中，研究者发现U1C-R21C或PRP8-S521F均可在很大程度上解释ev3的适应性；LUC7-G20V仅部分贡献于ev9的适应性，而SPT7-Y418Stop单独导入无显著效果。然而，由于SPT7-Y418Stop在单独检测时呈隐性且预测会导致SPT7开放阅读框截短，作者推测SPT7活性完全丧失对ev9适应性有贡献。蛋白免疫印迹证实ev9中全长SPT7已不可检测，且在祖先菌株中单独敲除SPT7即可改善适应性。因此，研究鉴定出两条补偿PRP28缺失的进化路径：一条是通过进一步修饰剪接机器本身（ev3），另一条则同时涉及剪接因子LUC7和SAGA转录共激活复合物组分SPT7（ev9）。

为探究SAGA复合物中哪项功能与ev9生长和剪接表型改善相关，作者在祖先菌株中分别敲除SPT7（维持SAGA完整性所需）、SPT8（SAGA介导的转录激活所需）、GCN5（组蛋白乙酰化）和UBP8（组蛋白去泛素化）。结果显示，SPT7缺失和SPT8缺失显著改善生长与剪接，而GCN5缺失和UBP8缺失仅产生微弱效应，提示转录活性的减弱是主要原因。此前全基因组研究已表明，RNA聚合酶II（Pol II）延伸速率加快会对剪接产生负面影响，而降低Pol II延伸速率则可改善剪接。因此作者提出假设：SAGA介导的适应性改善源于Pol II延伸变慢，为共转录剪接效率的提高提供了机会。为验证这一点，研究团队将多个已鉴定的RPB1突变体（改变Pol II转录速率）导入祖先菌株。结果发现，只有“慢速”的RPB1突变体能够改善剪接效率和细胞适应性，证明减慢或减少转录可以拯救低效剪接。

为进一步支持上述发现，作者通过体内4-硫尿嘧啶标记捕获新生转录本，定量检测新生RNA合成。结果显示，与祖先菌株相比，ev9和祖先SPT7缺失菌株中所有5个Pol II转录本（PMA1、BDF2、PGK1、GNP1和YEF3）的丰度均显著降低，而Pol I转录的5.8S核糖体RNA（RDN58）和Pol III转录的RNase P催化RNA（RPR1）的丰度无变化。值得注意的是，与野生型相比，祖先菌株和ev3的新生Pol II转录本水平也降低，尽管它们不含明显的转录相关突变，这表明转录与剪接在功能上相互影响。

此外，作者还分析了其他4个适应性进化品系（ev1、ev6、ev7和ev8）的剪接效率和新生RNA合成。结果显示，剪接改善与新生RNA产生的减少呈正相关，进一步支持祖先菌株在进化中有两条路径可以选择：单独重新优化剪接机器（ev1、ev3和ev7），或同时微调转录与剪接机器的相互作用（ev6、ev8和ev9）。

为了验证LUC7-G20V是否代表早期适应性步骤，研究者利用CRISPR-Cas9系统在祖先菌株中逐步引入LUC7-G20V和SPT7-Y418Stop。结果显示，单独LUC7-G20V即可提高细胞适应性和剪接效率，但仅对7个受测内含子中的1个有效；进一步加入SPT7-Y418Stop后，5/7个内含子的剪接效率及适应性都得到进一步改善。此外，研究发现单独的SPT7缺失或SPT7-Y418Stop均不能绕过对PRP28的需求，这与先前报道的LUC7作为修饰因子的情况不同。最近解析的全组装剪接体结构显示，LUC7和U1C共同夹持并稳定5′剪接位点/U1 snRNA双链，这为为什么修改U1C或LUC7（而不是其他已知修饰因子如PRP42、SNU71和CBP80）可以恢复细胞适应性提供了结构层面的解释。

主要结果与结论

本研究的核心发现可归纳为：在缺失必需剪接因子PRP28的酵母细胞中，适应性可以通过两条不同的补偿突变途径实现。其一为剪接机器的自身再优化（如U1C和PRP8的突变），其二为剪接与转录机制的同时调整（如LUC7和SAGA组分SPT7的突变）。生化与遗传分析证明，转录速率的减慢可以补偿剪接缺陷，从而提高细胞适应性；反过来，低效的剪接也会降低新生RNA的产量。这揭示转录和剪接之间存在双向的功能耦合与再同步机制，该机制对基因表达通路的稳健性具有重要贡献。作者据此提出，生物系统内的内在互联性可以被利用于补偿性进化和系统再优化。这一发现挑战了传统上认为必需基因丢失后细胞只能通过修饰看似不相关的生物学功能来存活的观念，证明有缺陷的剪接系统可以通过修改其他剪接组分或利用剪接与转录之间的功能连接得到拯救。研究的价值在于：从进化和系统生物学的角度揭示了基因必要性可以动态变化，以及功能偶联通路在补偿性进化中的普遍潜力，为理解基因组进化和基因表达网络的稳健性提供了实验依据。

研究亮点

该研究的亮点包括：通过实验进化结合全基因组测序和功能验证，解析了从必需基因丢失到恢复适应性的完整进化路径；鉴定出两条不同的分子策略，揭示了剪接机器内部再优化与转录-剪接跨通路重新同步的多样性；通过CRISPR-Cas9祖先重建实验验证了适应性突变的先后顺序与功能贡献；并结合剪接体结构信息，为适应性突变的选择提供了机制层面的解释。此外，本研究利用了新生RNA标记定量技术，直接证明了转录与剪接之间的双向功能影响，拓展了对真核基因表达调控耦合网络的理解。