香椿属植物基因组研究揭示根蘖繁殖的遗传机制

作者与发表信息

本研究的主要作者包括马继凯（Jikai Ma）、程强强（Qiangqiang Cheng）、钟秋微（Qiuwei Zhong）等，通讯作者为张璐（Lu Zhang）、郭春策（Chunce Guo）和曹福亮（Fuliang Cao）。研究团队主要来自江西农业大学江西省亚热带森林资源培育重点实验室及南京林业大学南方现代林业协同创新中心。该研究成果以题为《Chromosome-scale genomes of Toona fargesii provide insights into competency of root sprouting》的研究论文形式，于2025年5月发表在期刊 *Journal of Systematics and Evolution*（第63卷第3期，第567-582页）上，论文于2024年7月19日收稿，2024年10月8日接受。

学术背景与研究目的

本研究属于植物基因组学、进化生物学与发育生物学的交叉领域。研究对象为红花香椿（Toona fargesii A. Chev.），这是一种隶属于楝科（Meliaceae）香椿属的落叶乔木，以其珍贵的木材（俗称“中国桃花心木”）和药用价值而闻名。然而，由于自然更新障碍和长期过度采伐，红花香椿在中国的生存受到威胁。在野外，该物种的繁殖模式以根蘖（root sprouting）为主，这是一种从根部产生不定芽进行无性繁殖的克隆生长方式。虽然根蘖有助于种群在恶劣生境中扩张，但也可能降低遗传多样性并阻碍种群长期健康发展。此前，香椿属仅有香椿（*T. sinensis*）完成了全基因组测序，楝科的高质量基因组信息仍然稀缺，这严重阻碍了对红花香椿的再生、分类、进化及保护的基础研究。因此，本研究旨在：1）利用PacBio长读长测序和Hi-C技术，构建红花香椿高质量的染色体级别基因组；2）通过比较基因组学分析，探究香椿属的进化历史，特别是全基因组复制（Whole Genome Duplication, WGD）事件；3）结合转录组学和激素分析，揭示红花香椿根蘖能力的潜在遗传和分子调控机制，特别是植物激素（尤其是细胞分裂素）信号通路在其中的作用。

详细研究流程

本研究是一个系统性的多组学分析项目，流程严谨，环环相扣，主要包含以下步骤：

1. 样本采集与形态学/组织学观察：研究首先从江西农业大学校园和江西九连山国家级自然保护区采集了红花香椿的成熟组织（叶、花、芽）以及用于根蘖研究的三种类型根组织样本：根蘖（Root Sprouts, RS）、非根蘖根（Non-Root Sprouts, NRS，位于根蘖旁1-2厘米的地上根）和土壤根（Soil Roots, SR，地下5-10厘米的根）。每种根样本设置三个生物学重复。通过石蜡切片和显微观察，明确了根蘖起源于根皮层木栓形成层，其基部分化深入薄壁组织和次生韧皮部，从而为后续分子研究锁定了关键的发育阶段和组织类型。

2. 基因组测序、组装与质量评估：这是研究的核心基础工作。首先，通过流式细胞术和细胞遗传学检测，确认红花香椿为二倍体（2n = 2x = 56）。利用Illumina短读长测序进行基因组调查，预估基因组大小约为579.39 Mb，杂合率为0.39%。随后，使用PacBio Sequel II平台进行长读长测序，产生了覆盖深度30.64倍的HiFi reads。利用Hifiasm组装器进行*de novo*组装，获得了总大小为535.24 Mb的scaffold级别基因组，scaffold N50达到17.75 Mb。为进一步提升组装质量，研究采用了Hi-C技术进行染色体挂载。通过甲醛交联、限制性酶切、连接、建库和Illumina测序，获得了染色质空间互作数据。利用ALLHiC软件，将97.93%的组装序列锚定到28条假染色体上，最终获得了染色体级别的基因组，scaffold N50提升至18.59 Mb。通过BUSCO（99.3%完整）、CEGMA（96.37%完整）、Merqury（QV=45.376）和长末端重复组装指数（Long Terminal Repeat Assembly Index, LAI=21.34）等多种指标评估，证实了该基因组组装具有高度的连续性、完整性和准确性，达到参考级别质量。

3. 基因组注释与比较基因组学分析：对组装好的基因组进行系统注释。重复序列分析显示，52.08%的基因组由转座元件（Transposable Elements, TEs）组成，其中长末端重复序列（LTRs）占比最高（47.85%）。通过结合*de novo*预测、同源比对和转录组证据，共注释了33,056个蛋白质编码基因，平均每个基因包含5.54个外显子。此外，还注释了409个microRNA、901个tRNA和5032个rRNA等非编码RNA。为了解析红花香椿的进化地位，研究选取了包括红花香椿、香椿、甜橙（*Citrus sinensis*）、杧果（*Mangifera indica*）、阿月浑子（*Pistacia vera*）、拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）等在内的11个物种进行系统发育分析和分化时间估算。基于741个单拷贝直系同源基因构建的最大似然系统发育树显示，红花香椿与香椿大约在1670万年前（~16.7 Mya）发生分化。通过分析四重简并位点颠换率（4DTv）的分布，研究推断香椿属在红花香椿与甜橙分化（约6110万年前）之后，经历了一次近期的全基因组复制事件，时间大约在2210万年至5010万年前之间。这次WGD事件可能是驱动香椿属物种分化的关键因素。

4. 基因家族扩张/收缩与正选择分析：为了探究红花香椿的适应性进化，研究分析了基因家族的动态变化。结果显示，与最近共同祖先相比，红花香椿有1799个基因家族（包含5172个基因）发生了显著扩张，1301个基因家族（包含178个基因）发生了收缩。功能富集分析发现，扩张的基因家族显著富集在“次生代谢物生物合成”通路，其中包含49个与莽草酸（shikimate）生物合成相关的基因，这可能与红花香椿的药用成分（如酚类、黄酮类）及其独特的苦味有关。此外，在“植物激素信号转导”通路中，发现了13个*ARR*（*Arabidopsis Response Regulator*）基因家族成员的扩张。同时，研究还鉴定出355个在红花香椿谱系中经历正选择的基因，这些基因主要富集在膜整合成分、离子跨膜转运活性等GO类别，以及甘油磷脂代谢、范可尼贫血通路等KEGG通路中。

5. 转录组分析与关键基因鉴定：为了直接探究根蘖的分子机制，研究利用前期获得的红花香椿根组织转录组数据（RS, NRS, SR），进行了差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）分析。在RS与NRS的比较中，共鉴定出718个DEGs。KEGG通路富集分析显示，这些DEGs最显著地富集在“玉米素（zeatin）生物合成”通路（属于植物激素信号转导大类）。进一步分析发现，多个与细胞分裂素（Cytokinin, CK）生物合成（如*LOG*基因）、信号转导（如AHK, AHP, *ARR*基因）和降解（*CKX*基因）相关的基因在根蘖中表达发生显著变化。特别值得注意的是，多个B型*ARR*基因（如TfARR1, TfARR2, TfARR4, *TfARR12*）在根蘖中上调表达。此外，一些与分生组织建立和干细胞命运决定相关的关键基因，如*WUSCHEL*相关同源框基因（WOX2, WOX3, WOX5, *WOX9*）以及*PLETHORA*（*PLT*）基因也在根蘖中显著上调。

6. 激素定量分析与RT-qPCR验证：为了验证转录组分析的发现，研究使用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定了三种根组织中细胞分裂素和生长素的含量。结果显示，在根蘖组织中，细胞分裂素的核糖核苷形式（如反式玉米素核苷tZR、异戊烯基腺苷iPR）含量显著高于其他组织，而重要的生长素吲哚-3-乙酸（IAA）及其相关产物在根蘖中的含量较低。这表明根蘖发育过程中存在一个较低的IAA/CK-核糖核苷比值。同时，研究选取了10个候选DEGs进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证，结果与转录组数据高度一致，证实了测序结果的可靠性。

主要研究结果

1. 高质量染色体级别基因组：成功构建了红花香椿首个染色体级别的基因组，大小为535.24 Mb，锚定到28条假染色体上，组装质量高（LAI=21.34，BUSCO完整度99.3%），为楝科植物和香椿属的遗传研究提供了宝贵的基因组资源。

2. 进化历史与WGD事件：系统发育分析明确了红花香椿在香椿属内的进化位置，其与香椿的分化时间约为1670万年前。4DTv分析揭示了香椿属在2210-5010万年前发生了一次近期的全基因组复制事件，该事件可能促进了新基因功能的产生和物种分化。

3. 基因家族扩张揭示物种特性：红花香椿经历了显著的基因家族扩张，特别是在次生代谢（如莽草酸途径）和植物激素信号转导（如*ARR*基因家族）通路。13个*ARR*基因的扩张，暗示了细胞分裂素信号通路在红花香椿适应性进化（尤其是根蘖能力）中可能扮演了关键角色。此外，与花青素合成相关的苯丙烷类途径中13个基因的扩张，可能与红花香椿独特的紫色花朵形成有关。

4. 根蘖发育的细胞学基础：组织学观察明确了根蘖起源于根皮层的木栓形成层，其原基突破表皮，基部与母根的木质部通过薄壁细胞相连并逐渐木质化，为理解根蘖的解剖学起源提供了直接证据。

5. 转录组揭示根蘖的分子调控网络：转录组分析表明，根蘖与非根蘖组织之间的差异表达基因显著富集于细胞分裂素生物合成与信号通路。B型*ARR*基因（如*TfARR12*）的上调，以及*WOX*、*PLT*等分生组织关键基因的表达变化，勾勒出一个以细胞分裂素信号为核心的、调控根尖分生组织（SAM）建立和干细胞命运的基因网络。

6. 激素水平支持细胞分裂素的核心作用：激素定量分析为转录组结论提供了生化证据。根蘖组织中高水平的细胞分裂素核糖核苷和低水平的IAA，证实了较低的IAA/CK比值是根蘖启动和发育的关键激素环境，这与植物组织培养中诱导不定芽再生的经典理论相一致。

结论与意义

本研究首次报道了红花香椿的高质量染色体级别基因组，填补了楝科植物基因组资源的空白。通过整合比较基因组学、转录组学和激素组学分析，系统揭示了红花香椿根蘖繁殖能力的遗传和分子基础。主要结论如下：

1. 基因组资源价值：发布的红花香椿基因组是香椿属乃至楝科植物的一个重要参考基因组，为后续的种群遗传学、功能基因组学、分子育种和保护生物学研究奠定了基础。
2. 进化启示：发现的近期WGD事件为理解香椿属物种的起源和多样性提供了新的进化视角。基因家族扩张分析提示，次生代谢途径和激素信号通路的基因复制可能与红花香椿的药用特性、抗逆性及独特的繁殖策略等性状演化密切相关。
3. 根蘖机制解析：研究综合证据表明，红花香椿的根蘖能力受到一个精细调控的分子网络控制。该网络以细胞分裂素信号通路为核心，其关键节点包括：
   • 激素平衡：根蘖部位维持着一个低IAA/高CK（特别是核糖核苷形式）的激素微环境。
   • 信号转导：扩张且上调表达的B型*ARR*基因（如*TfARR12*）介导了细胞分裂素信号。
   • 分生组织重建：细胞分裂素信号通过调控*WOX*（如*WOX2/3/5/9*）和*PLT*等关键转录因子，促进根皮层细胞重编程，建立新的茎尖分生组织，最终形成根蘖芽。
4. 生态与保护意义：研究从分子层面解释了红花香椿在野外为何倾向于采用根蘖这种克隆繁殖策略。这种策略可能是在特定环境压力（如种子繁殖障碍、生境恶劣）下的一种适应性进化结果。然而，过度依赖根蘖会导致遗传多样性下降。该研究为通过分子标记辅助选择、调控激素途径等手段，在保护中促进其有性繁殖、维持种群遗传健康提供了科学依据和潜在的基因靶点。

研究亮点

1. 资源创新性：发布了首个红花香椿及香椿属内第二个染色体级别的高质量基因组，是楝科植物基因组学的重要进展。
2. 多组学整合：研究并非停留在基因组测序，而是将基因组、比较基因组、转录组、激素组和组织学观察深度整合，形成了一个从宏观性状到微观机制的完整证据链，论证严谨。
3. 机制深度挖掘：不仅描述了根蘖现象，更深入揭示了其背后的核心调控通路——细胞分裂素信号转导，并初步构建了涉及*ARR*、*WOX*、*PLT*等关键基因的调控网络模型，将表型与核心分子通路明确关联。
4. 进化与发育结合：将物种进化历史（WGD事件、基因家族扩张）与特定发育性状（根蘖）的遗传基础联系起来，为理解性状的起源与演化提供了范例。
5. 应用潜力明确：研究成果直接指向珍稀树种保护、林木无性繁殖技术改良等应用方向，具有明确的科学价值和应用前景。

其他有价值的内容

研究还发现了一些有趣的点，例如红花香椿特有的紫色花性状可能与扩张的苯丙烷类代谢途径基因有关；其苦涩口感可能与扩张的莽草酸途径基因相关，这可能同时增强了其抗虫抗病能力。这些发现为深入挖掘红花香椿的观赏、药用和抗逆价值提供了新的基因资源线索。该研究是一项系统性、多层次的优秀工作，为理解木本植物克隆繁殖的遗传基础提供了重要案例和丰富数据。