本研究由Zeynep Efsun Duman-Özdamar（第一作者）、Mattijs K. Julsing、Janine A.C. Verbokkem、Emil Wolbert、Vitor A.P. Martins dos Santos、Jeroen Hugenholtz和Maria Suarez-Diez（通讯作者）共同完成。作者们来自荷兰瓦赫宁根大学及研究中心的生物过程工程实验室、系统与合成生物学实验室、瓦赫宁根食品与生物基研究中心，以及德国Lifeglimmer GmbH、阿姆斯特丹大学和阿姆斯特丹大学斯瓦默丹生命科学研究所、Nopalm Ingredients BV等机构。这项研究于2025年1月31日在线发表在学术期刊《Bioresource Technology》上，文章标题为“Model-driven engineering of Cutaneotrichosporon oleaginosus ATCC 20509 for improved microbial oil production”。

学术背景 本研究属于微生物代谢工程与合成生物学领域，具体聚焦于利用产油酵母生产微生物油脂。棕榈油因其廉价和功能性被广泛使用，但其不可持续的生产方式导致了严重的生态问题，如森林砍伐和气候变化。因此，开发可持续的替代油脂来源迫在眉睫。产油酵母，尤其是能够积累超过20%细胞干重油脂的菌株，被认为是极具潜力的替代方案。其中，产油丝孢酵母（*Cutaneotrichosporon oleaginosus*，曾用名包括 Cryptococcus curvatus 等）因其可利用多种碳源（包括工业废料如粗甘油）并积累高达40%以上的油脂而备受关注。然而，要实现其工业化应用，必须进一步提高其油脂产量和产率以提升经济可行性。此前的研究表明，通过代谢工程和培养条件优化可以提升油脂产量，但针对 C. oleaginosus 的系统性工程研究仍然有限。本研究旨在应用“设计-构建-测试-学习”（Design-Build-Test-Learn, DBTL）这一系统化循环策略，结合转录组学分析和基因组尺度代谢模型（Genome-scale metabolic model, GEM）的预测，对 C. oleaginosus ATCC 20509进行代谢工程改造和培养基优化，以建立高效、可持续的微生物油脂生产平台。

详细工作流程 本研究严格遵循DBTL循环框架，分为设计、构建、测试和学习四个主要阶段。

第一阶段：设计（Design） 此阶段的目标是通过整合多组学数据和计算模型，识别能够提高油脂积累的基因过表达靶点和培养基补充物。 1. 转录组数据分析： 研究团队在两种对比条件下培养了 C. oleaginosus 的野生型（WT）以及Δ9-去饱和酶和Δ12-去饱和酶敲除菌株：高碳氮比（C/N）条件（60%粗甘油蒸馏可溶物，CDS）和低碳氮比条件（10% CDS），后者能诱导更高的油脂积累。对这三个菌株进行了RNA测序（RNA-seq）。通过差异表达分析（使用DESeq2软件），筛选出在高油脂积累条件下共同上调和下调的基因。分析中设定了严格的阈值：校正后p值≤0.05，且log2倍数变化≥0.58或≤-0.58（即变化倍数≥1.5倍）。 2. 基因本体富集分析和代谢通路可视化： 对共同差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析（使用Cytoscape的BINGO插件），发现了在碳水化合物生物合成、丙酮酸代谢、脂质和脂肪酸生物合成以及维生素代谢过程中显著富集的基因。同时，将差异表达基因映射到基于已发表的 C. oleaginosus GEM模型（iNP636）构建的中央碳代谢和脂质合成通路图（使用Escher工具）上，直观显示关键基因的表达变化。 3. 基于GEM模型的比较通量采样分析： 利用更新后的 C. oleaginosus 基因组尺度代谢模型（iNP636_coleaginosus_atcc20509_v2），通过比较通量采样分析（Comparative Flux Sampling Analysis, CFSA）模拟了三种代谢状态：最大生长、最大脂质生产和慢速生长。该分析预测了一系列可能提高脂质生产的基因过表达靶点，并识别了一个下调靶点。 4. 靶点筛选： 综合转录组分析和CFSA的预测结果，研究团队最终选择了四个基因作为过表达靶点：ATP-柠檬酸裂解酶（*acl1*）、乙酰-CoA羧化酶（*acc*）、苏氨酸合酶（*ts*）和羟甲基戊二酰-CoA合酶（*hmgs*）。同时，基于GO分析中维生素代谢相关基因的上调以及CFSA对氨基酸代谢的预测，选择了五种培养基补充物进行验证：生物素、硫胺素、苏氨酸、丝氨酸和天冬氨酸。

第二阶段：构建（Build） 此阶段旨在建立遗传操作工具并构建工程菌株。 1. 遗传工具开发： 本研究首次为 C. oleaginosus 建立了一种基于电穿孔的共转化方法。使用诺尔丝菌素乙酰转移酶基因（*nat*）作为抗性选择标记。 2. 质粒构建与菌株构建： 将筛选出的四个靶基因（acl1, acc, ts, *hmgs*）分别与内源性强启动子（如 pgpd, ptef1 等）和终止子组合，由Genscript公司合成在pUC57-mini骨架载体上。通过将线性化的靶基因质粒与含有 nat 标记的质粒共转化到 C. oleaginosus 中，成功构建了四个过表达工程菌株，分别命名为ACL、ACC、TS和HMGS。通过菌落PCR和qPCR验证了外源基因的稳定整合和过表达。qPCR结果显示，TS基因的过表达水平相对较低，而HMGS基因的mRNA水平比野生型高出1080倍。

第三阶段：测试（Test） 此阶段对预测的培养基补充物和构建的工程菌株进行实验验证。 1. 培养基补充物验证： 在C/N比为120的基本培养基（以甘油为碳源，尿素为氮源）中，分别添加生物素、硫胺素、苏氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，培养野生型菌株。通过测量96小时后的油脂含量、生物量和油脂对甘油的产率（Yp/s）来评估效果。油脂含量通过气相色谱（GC）定量总脂肪酸测定，生物量通过光密度换算为细胞干重，甘油消耗通过高效液相色谱（HPLC）分析。 2. 工程菌株表征： 将构建的ACL、ACC、TS和HMGS工程菌株以及野生型对照，在C/N比分别为30、120、175、200和300的基本培养基中进行培养（HMGS菌株仅在C/N 30和175下测试）。同样在96小时后，系统测量了它们的生长、油脂含量、油脂产量以及脂肪酸组成。

第四阶段：学习（Learn） 此阶段对测试结果进行深入分析和模型拟合，以指导下一轮优化。 1. 数据分析与模型拟合： 使用R语言对工程菌株在不同C/N比下的性能数据（油脂含量、细胞干重、油脂重量）进行二次回归分析，拟合出曲线方程（y = ax² + bx + c），并通过方差分析（ANOVA）评估模型显著性。通过计算曲线的峰值，预测了各菌株达到最佳油脂生产性能的最适C/N比。 2. 结果解释与机制探讨： 结合实验结果和模型预测，深入讨论了各靶点基因和补充物如何影响代谢流，从而改变油脂积累。例如，解释了苏氨酸补充和TS过表达可能通过平衡草酰乙酸水平和增强TCA循环活性来促进脂质合成。

主要结果 设计阶段结果： 转录组分析揭示了在高油脂积累条件下，与脂质合成（如 acl1, *acc*）、NADPH供应（如 *gnd1*）和维生素代谢相关的基因显著上调。GO富集分析进一步确认了这些通路。CFSA分析成功预测了包括 acl1, acc, ts, hmgs 在内的25个过表达靶点和1个下调靶点。这些计算预测为后续实验提供了明确的指导。

构建阶段结果： 成功建立了 C. oleaginosus 的共转化系统，并构建了四个过表达菌株。qPCR证实了靶基因的过表达，特别是HMGS菌株表达量极高，为功能验证奠定了基础。

测试阶段结果： 1. 培养基补充物： 添加生物素使油脂含量从47.27%显著提高到56.19%（w/w），油脂产率（Yp/s）从0.20提高到0.25 g/g。添加苏氨酸使油脂含量提高至50.20%，生物量提高约17%，Yp/s提高至0.24 g/g。硫胺素、丝氨酸和天冬氨酸的补充未对油脂积累产生显著影响。脂肪酸组成分析显示，补充苏氨酸和丝氨酸增加了多不饱和脂肪酸（PUFAs）的比例。 2. 工程菌株性能： 在C/N比为30和300的条件下，ACL、ACC和TS菌株的油脂积累均显著高于野生型。特别是在C/N 300时，ACL的油脂含量比野生型（37.8%）提高了约40%，油脂重量提高了1.6倍。TS菌株在C/N 200时达到了最高的52.35%油脂含量。所有三个菌株（ACL, ACC, TS）在C/N 300时的Yp/s均达到约0.27 g/g，比野生型（0.20 g/g）提高了1.35倍，且接近理论最大值（~0.30 g/g）。重要的是，在高C/N比（300）下，野生型的生长和产油受到抑制，而ACL、ACC和TS菌株则表现出更强的鲁棒性，说明工程改造缓解了高底物浓度可能带来的抑制。HMGS过表达菌株在所有测试条件下均未显示出油脂积累的改善。脂肪酸组成分析表明，TS过表达导致饱和脂肪酸和超长链脂肪酸（如C22:0, C24:0）含量增加。

学习阶段结果： 二次回归模型预测，ACC和TS菌株获得最高总脂量的最适C/N比向250移动，而ACL菌株的最适C/N比预测为310，高于野生型的185。这证实了工程菌株更适合在高C/N比条件下运行，为工艺优化提供了定量指导。

结论与意义 本研究成功应用DBTL循环，系统化地提升了 C. oleaginosus 的微生物油脂生产能力。主要结论包括： 1. 结合转录组学和代谢模型分析，是有效识别脂质合成关键靶点的强大策略。 2. 生物素和苏氨酸是有效的培养基补充剂，能显著提高野生型菌株的油脂含量和产率。 3. 过表达 acl1, acc 和 ts 基因能显著增强 C. oleaginosus 的油脂积累能力，尤其在较高C/N比条件下优势明显，表明工程菌株对底物浓度波动具有更好的鲁棒性。 4. 建立的共转化方法和鉴定的内源遗传元件（启动子、终止子）为 C. oleaginosus 的后续遗传操作提供了宝贵工具。 5. 该研究将 C. oleaginosus 的油脂产率提升至0.27 g甘油/g脂质，接近理论极限，为其作为棕榈油可持续替代品的工业化应用奠定了坚实的科学和技术基础。

研究亮点 1. 系统性方法： 首次在 C. oleaginosus 中完整应用DBTL循环，整合了多组学数据、计算模型和实验验证，为微生物细胞工厂开发提供了范例。 2. 工具创新： 首次报道了适用于 C. oleaginosus 的基于电穿孔的共转化方法，扩展了该菌株的遗传操作工具箱。 3. 靶点新颖性： 除了验证经典的脂质合成关键酶（ACL, ACC）外，首次在 C. oleaginosus 中提出并验证了苏氨酸合酶（TS）作为提高油脂产量的有效靶点，并探讨了其通过平衡TCA循环中间代谢物来促进脂质合成的潜在机制。 4. 性能显著提升： 获得的工程菌株在油脂含量、产率以及对高底物浓度的耐受性方面均有显著提升，性能指标处于同类研究前列。 5. 应用导向明确： 研究直接针对利用粗甘油等废弃碳源生产微生物油脂的工业需求，所获菌株和优化策略具有明确的实际应用潜力。

其他有价值的内容 研究还探讨了HMGS过表达未产生效果的可能原因，即过高的表达水平可能反而扰乱了代谢平衡，提示未来需要进行更精细的（如启动子工程）调控。此外，对工程菌株脂肪酸组成的分析表明，通过代谢工程不仅可以提高油脂总量，还有潜力定向改变油脂的组成，从而生产具有特定用途的定制化油脂。文章提供的详细实验方法、质粒信息和数据分析代码（通过Zenodo共享）为领域内同行重复和拓展本研究提供了便利。