该研究由常州大学药学院及多家合作机构的杨东（Dong Yang）、龚磊（Lei Gong）、李青（Qing Li）等人共同完成，通讯作者为常州大学的何玉财（Yu-Cai He）教授。论文发表于《International Journal of Biological Macromolecules》期刊第227卷（2023年），并于2022年12月在线发表。

一、 研究背景与目的

该研究属于生物基高分子材料与抗菌科学领域。随着社会对日常生活中的安全与健康问题（如医疗器械和食品包装）的关注，开发具有抗菌活性且成本低廉的材料成为重要研究方向。传统抗菌材料如银、金纳米颗粒（nanoparticles）存在一定的毒性和高成本问题，而天然聚合物（natural polymers）作为抗菌原料成为另一选择。壳聚糖（Chitosan, CTS）和羧甲基纤维素钠（Sodium carboxymethyl cellulose, CMC-Na）是两种来源丰富的天然多糖衍生物，分别由几丁质（chitin）和纤维素（cellulose）衍生而来。壳聚糖虽具有广谱抗菌性，但仅能溶于酸性体系，且力学性能较差；羧甲基纤维素钠虽有良好的水溶性和生物相容性，但其抗菌能力和机械强度有限。为克服单一材料的局限性，本研究旨在通过一种简单、低成本且无需额外化学交联剂的物理共混法，制备由这两种带相反电荷的生物基聚电解质（bio-based polyelectrolytes）通过强静电相互作用形成的聚电解质复合物（Polyelectrolyte Complex, PEC）。研究的核心目标是系统探究反应体系的pH值、两种材料的质量比、搅拌速度及温度等因素对PEC合成的影响，以期获得一种具有高吸水性和抗菌性能、且拥有交联空泡结构的生物基PEC，为低成本合成抗菌材料提供理论支撑和策略。

二、 研究流程与方法

研究工作主要分为以下几个核心环节：

1. PEC的制备与工艺优化： 研究人员首先配置了特定质量分数（1 wt%和2 wt%）的CMC-Na水溶液和CTS醋酸溶液。制备PEC的基本流程是，在25°C下，将CTS溶液缓慢倒入等体积的CMC-Na溶液中，通过磁力搅拌器（magnetic stirrer）进行物理共混。在这一过程中，CTS分子链上质子化的氨基（-NH₃⁺）与CMC-Na分子链上电离的羧基（-COO⁻）发生强静电相互作用，形成具有交联结构的复合物。为了系统研究制备条件对PEC产率（yield）和吸水倍率（Bibulous Rate, BIR）的影响，实验设计了一系列单因素变量。具体包括：设置了四种不同的CMC-Na与CTS的质量比（1:0.5, 1:1, 1:2, 2:1）；在不同质量比下，将反应体系的pH值分别调节为2、3、4、5、6和8；在确定最佳质量比和pH值后，考察了搅拌速度（200, 400, 600, 800, 1000 rpm）和反应温度（4, 25, 60, 80 °C）对PEC产率的影响。PEC的产率是通过紫外-可见分光光度计（Ultraviolet-visible spectrophotometer）测定反应后上清液中未反应CTS的含量，并利用标准曲线和特定公式（公式1）计算得出的。

2. 结构与性能表征： 在最优条件下（质量比CMC-Na:CTS=1:2，pH=5，25°C，800 rpm，2 min）制备出PEC后，采用了多种分析技术对其进行表征。通过X射线衍射（XRD）分析CTS、CMC-Na及其复合物PEC的晶体结构和结晶度指数（CrI）；利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征各组分及PEC的化学结构和官能团间的相互作用。

3. 抗菌活性评估： 抗菌性能测试选取了两种细菌——革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538），以及一种真菌——酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763）作为研究对象。实验采用两种方法进行：(1) 琼脂扩散法（Agar diffusion assay），将制备好的PEC样品放置在接种有菌液的固体培养基表面，培养24小时后观察抑菌圈。(2) 液体培养浊度法，将PEC加入含菌的液体培养基中，共培养12小时或20小时后，通过紫外分光光度计测定在600 nm波长下的光密度（OD600）值，并依据公式3计算抑菌率（Bacteriostasis Ratio, BR）。

三、 主要结果与讨论

1. 制备条件对PEC产率的影响： 研究发现，pH值对PEC产率的影响至关重要且具有普遍规律。无论CMC-Na与CTS的质量比如何，当体系pH从5降至2时，PEC产率均急剧下降直至为零。例如，在质量比为1:0.5的体系中，产率从pH 5时的32.7%降至pH 2时的0%。这是因为在过低pH（如3）时，CMC-Na的羧基主要以未电离形式存在，导致与CTS的静电结合力弱，形成的PEC为独立的球状颗粒，产率低。当pH值升至4-6范围时，CMC-Na侧链上带负电的羧基数量增加，同时CTS的氨基仍保持质子化状态，两者间的静电引力增强，形成的PEC呈现相互连接的絮状结构，交联形成的空泡结构致密，产率也随之升高并趋于稳定。当pH为8时，由于CTS在碱性条件下溶解性降低并析出，导致交联结构破坏，出现白色团块。在相同pH值下，PEC产率与CTS浓度呈正相关。在pH=5时，使用0.5 wt%、1 wt%和2 wt%浓度CTS所得的PEC产率分别为32.7%、55.6%和71.2%，表明更高的CTS浓度提供了更多的正电荷位点。

2. 制备条件对PEC吸水倍率的影响： 对在不同pH下制备的PEC进行吸水倍率测试，结果显示，在pH 2至6范围内，BIR随pH升高而增加。当pH为4时，静电作用增强导致复合物结构紧凑；而pH升至6时，由于CTS的氨基质子化程度降低，交联密度下降，结构变得疏松，从而能够吸收并容纳更多水分，BIR因此提高。当pH达到8时，CTS沉淀导致致密交联结构消失，BIR随之降低。这一结果也解释了为何后续抗菌测试中，pH=5条件下制备的PEC比pH=6的具有更优的抗菌性能：更致密的结构可能更有利于控制和缓释内部的活性物质CTS。

3. 搅拌速度与温度的影响： 实验表明，搅拌带来的剪切力对PEC的形成至关重要。由于两种溶液粘度较高，直接混合仅能在接触面形成巨大的块状絮凝物。使用磁力搅拌器提供剪切力，可以显著增加两相的接触面积。在800 rpm的转速下搅拌2分钟获得了71.2%的最高产率。搅拌速度过低(<800 rpm)会形成包裹搅拌桨的大块絮体，而过高(>800 rpm)则对产率和结构无明显改善，这与剪切力影响絮体尺寸的理论一致。温度实验显示，4°C和25°C下的产率（分别为68.9%和71.2%）无显著差异，但当温度升至25°C以上时，产率下降。这证实了CMC-Na与CTS之间的静电结合是一个放热过程，高温不利于复合物的形成，同时也可能因CTS构象压缩而减少其有效的作用位点。

4. 结构表征的发现： XRD谱图显示，纯CTS在2θ=12.54°和20.03°有特征衍射峰，CMC-Na在19.94°有衍射峰。而两者复合形成的PEC，其衍射峰位置和形状发生了显著变化，在11.31°、22.46°和41.37°处出现新的峰，并且峰形宽化，结晶度指数（CrI）为32.14。这表明复合后原有的晶体结构被破坏，两种聚合物分子链重新排列，形成了新的无定形结构。FT-IR谱图分析进一步证实了这一点，PEC的谱图中同时包含了CTS和CMC-Na的特征吸收峰，并且在1593.02 cm⁻¹和1630.87 cm⁻¹处分别出现了归属于-NH₃⁺和-COO⁻基团的振动峰，这直接证明了在酸性条件下，壳聚糖的质子化氨基与CMC-Na的电离羧基之间成功发生了静电交联。

5. 抗菌活性评价： 琼脂扩散实验表明，在pH=5条件下制备的PEC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有良好的抑制作用，但对酿酒酵母的抑制效果较差。而在pH=6条件下制备的PEC，其抗菌性能大幅降低，这与其结构更疏松，可能释放活性物质过快或在培养基中稳定性差有关。液体培养浊度法定量结果显示，在pH=5下制备的PEC，共培养12小时后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为18.7%和31.3%，对酿酒酵母的抑菌率仅为11.1%。PEC对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于大肠杆菌，这是由于两者细胞壁结构差异所致：作为革兰氏阳性菌，金黄色葡萄球菌的细胞壁主要由带负电荷的肽聚糖层组成，而作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌，其外膜还含有脂多糖和脂蛋白构成的额外屏障。抗菌机制解释为：PEC的交联空泡结构包裹了CTS，在菌液中提供酸性微环境并持续释放出质子化氨基的CTS（-NH₃⁺），这些带正电的基团能与细菌膜上的负电成分（如脂质和蛋白质）相互作用，破坏膜的完整性，导致细菌死亡。

四、 研究结论与价值

本研究成功开发了一种制备生物基聚电解质复合物（PEC）的有效策略。该策略的核心优势在于：仅使用壳聚糖和羧甲基纤维素钠两种天然多糖为原料，在整个制备过程中无需添加任何有毒的化学交联剂，仅通过在水相酸性体系中的简单物理共混，借助磁力搅拌器提供的均匀剪切力，即可在室温下、极短的时间内（2分钟）以71.2%的高产率获得具有交联空泡结构的PEC。研究系统阐明了制备参数（pH、质量比、搅拌、温度）对PEC产率和结构的关键影响，并证实了其交联机理是质子化氨基与电离羧基的静电作用。所得的PEC兼具高吸水性和持续抗菌性能，其抗菌作用源自空泡结构对壳聚糖的包裹与缓释。该工作为利用可再生生物质资源，通过低成本、绿色的工艺合成新型抗菌材料提供了坚实的理论依据和实践可能，例如在创伤敷料等领域的应用，具有重要的科学价值和应用前景。

五、 研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下三个方面： 其一，方法学的创新与简化。区别于众多需要复杂处理工艺和外加交联剂的PEC制备方法，该研究首次通过精确调控物理共混参数（特别是利用磁力搅拌提供均匀剪切力来控制反应接触面和产物微观结构），在室温下实现了无需任何化学交联剂的、具有规则空泡结构的PEC的快速、高效制备。 其二，对构效关系的系统阐释。研究不仅关注产率，还深入探究了不同pH条件下制备的PEC其微观结构（致密或疏松）与宏观性能（吸水性、抗菌活性）之间的内在逻辑关系，清晰揭示了反应体系pH如何通过影响壳聚糖的电离状态和复合物的交联密度，最终决定其作为抗菌材料的应用潜力。 其三，清晰的抗菌机理模型。基于实验结果，论文提出了一个直观的抗菌模型：PEC的交联空泡结构作为一个“仓库”，包裹并保护壳聚糖，并在应用环境中通过持续释放具有质子化氨基的活性壳聚糖，实现对细菌细胞膜的攻击，这为设计缓释型多糖基抗菌材料提供了新思路。