本研究由来自中国农业大学草业科学与技术学院的王婷婷、杨佳琦、曹佳敏、张琦、刘华玥、李鹏、黄一智、钱文武、毕晓静，以及通讯作者王辉副教授和张蕴微教授共同完成。该研究论文《msbzip55 regulates salinity tolerance by modulating melatonin biosynthesis in alfalfa》已于2025年2月14日接收，发表于国际期刊《Plant Biotechnology Journal》（2025年卷23期，2125–2139页）。这项研究深入探讨了苜蓿应对盐胁迫的分子机制，揭示了转录因子MsBZIP55通过调控褪黑素（melatonin）生物合成关键基因MsSNAT1的表达，从而影响苜蓿耐盐性的新通路。
研究学术背景 土壤盐渍化是全球范围内影响农作物生长和产量的主要非生物胁迫之一。盐胁迫会引发渗透胁迫、离子毒害和活性氧（reactive oxygen species, ROS）累积，进而抑制光合作用、导致代谢紊乱和生长停滞。植物在长期进化中形成了一系列复杂机制以应对盐胁迫，其中，褪黑素作为一种在动植物中保守的强效抗氧化剂和自由基清除剂，已被证明在缓解多种非生物胁迫（包括盐胁迫）中发挥关键作用。在植物中，褪黑素由色氨酸经过多步酶促反应合成，其中，5-羟色胺N-乙酰转移酶（serotonin N-acetyltransferase, SNAT）是限速酶。尽管褪黑素在植物抗逆中的作用已被广泛研究，但其生物合成的上游转录调控机制，特别是在重要牧草作物苜蓿中，仍不甚清楚。
苜蓿被誉为“牧草之王”，但其生长和产量常受土壤盐分的限制。前人研究表明，外源施加褪黑素可提高苜蓿的耐盐性，然而，其内在的调控通路尚不明确。本研究旨在填补这一空白，其核心目标是：1) 鉴定并表征苜蓿中参与褪黑素生物合成的关键基因MsSNAT1在盐胁迫下的功能；2) 寻找并验证调控MsSNAT1表达的上游转录因子；3) 阐明该调控模块（MsBZIP55-MsSNAT1）如何通过影响褪黑素合成来调控苜蓿的耐盐性。
详细研究流程 本研究流程系统且环环相扣，主要包括以下六个核心环节：
第一环节：MsSNAT1的鉴定、表达分析与功能验证。 研究首先通过生物信息学比对，从苜蓿蛋白数据库中鉴定出拟南芥和水稻SNAT1的同源基因，命名为MsSNAT1。通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析，证实MsSNAT1的表达在100 mM NaCl处理6小时后被显著诱导，表明其响应盐胁迫。为了探究其功能，研究团队构建了MsSNAT1的过表达（MsSNAT1-OE）转基因苜蓿株系。通过农杆菌介导的遗传转化，获得了多个独立转基因株系，并筛选出两个高表达株系（#3和#10）进行后续表型分析。RT-qPCR和褪黑素含量测定证实，过表达株系中MsSNAT1转录本和内生褪黑素水平均显著高于野生型（WT）。在300 mM NaCl长期盐胁迫下，MsSNAT1-OE植株表现出比WT更轻的叶片黄化和萎蔫现象，显示出更强的耐盐表型。
为了深入解析其耐盐机制，研究进行了一系列生理生化测定。结果显示，在盐胁迫下，MsSNAT1-OE株系的叶片具有更高的叶绿素含量、更低的过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（MDA）积累、更低的电解质渗透率（EL），并且二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色更浅，表明其ROS积累更少。同时，其抗氧化酶系统（包括过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD、铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD）的活性及相关基因表达水平在盐胁迫后也显著高于WT。此外，离子含量测定发现，盐胁迫后MsSNAT1-OE植株叶片和根部的Na⁺含量更低，K⁺含量与WT无显著差异，从而导致其Na⁺/K⁺比显著低于WT。与离子稳态相关的基因，如质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因MsSOS1和液泡膜Na⁺(K⁺)/H⁺逆向转运蛋白基因MsNHX1的表达也在过表达株系中上调。相反，通过RNA干扰（RNAi）技术敲低MsSNAT1表达的植株（MsSNAT1-RNAi），其内生褪黑素水平降低，并在盐胁迫下表现出更敏感的表型。这些结果共同证明，MsSNAT1通过提高褪黑素合成、增强抗氧化能力和维持离子稳态，正调控苜蓿的耐盐性。
第二环节：MsSNAT1上游转录因子的筛选与鉴定。 为了找到调控MsSNAT1表达的“开关”，研究团队对盐胁迫处理（100 mM NaCl, 3小时）的苜蓿幼苗进行了转录组测序（RNA-seq）分析。通过差异表达分析，并结合对MsSNAT1启动子区（2.7 kb）顺式作用元件的预测，从盐响应转录因子中初步筛选出11个可能靶向MsSNAT1的候选转录因子。
第三环节：双荧光素酶报告基因与GUS活性测定进行初筛。 研究构建了双荧光素酶报告系统进行体外验证：以MsSNAT1的启动子驱动萤火虫荧光素酶（Luc）作为报告基因，以35S启动子驱动候选转录因子与GFP的融合蛋白作为效应子，共注射本氏烟草叶片。通过检测Luc活性相对于内参海肾荧光素酶（REN）活性的比值，来评估转录因子对MsSNAT1启动子的激活或抑制效应。结果显示，三个候选转录因子（Msg0780041366、Msg0880043078和Msg0280006603）对启动子活性有显著影响。其中，Msg0880043078和Msg0280006603显著抑制了Luc活性，而Msg0780041366则激活了活性。使用相同的启动子驱动β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因的共注射实验，通过组织化学染色进一步验证了这一结果。
第四环节：转基因验证与关键转录因子MsBZIP55的确定。 为了在苜蓿体内验证上述结果，研究分别构建了这三个转录因子的过表达转基因植株。通过RT-qPCR分析发现，只有过表达Msg0880043078的植株中，MsSNAT1的表达被一致且显著地下调，同时内生褪黑素含量也降低。系统进化树分析表明，Msg0880043078与拟南芥的AtBZIP55亲缘关系最近，因此将其命名为MsBZIP55。亚细胞定位实验证实MsBZIP55-GFP融合蛋白定位于细胞核，符合转录因子的特征。RT-qPCR分析显示，MsBZIP55本身的表达在盐胁迫3小时后被强烈诱导。
第五环节：MsBZIP55直接结合MsSNAT1启动子的证据。 研究通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）实验，从体外和体内两个层面证明了MsBZIP55对MsSNAT1启动子的直接结合。EMSA实验使用重组纯化的MsBZIP55-His蛋白与生物素标记的、含有预测G-box元件的MsSNAT1启动子片段探针进行孵育。结果表明，MsBZIP55蛋白能与三个不同的启动子区域（P1， P2， P3）特异性地结合，这种结合可被过量未标记的相同探针（特异性竞争）所竞争，但不能被突变探针（非特异性竞争）所影响。体内ChIP-qPCR实验则利用过表达GFP-MsBZIP55融合蛋白的转基因苜蓿植株，使用GFP抗体进行免疫沉淀。结果发现，与未加抗体的对照相比，使用GFP抗体沉淀的染色质中，MsSNAT1启动子上的P1， P2， P3区域均被显著富集。这两项实验确凿地证明了MsBZIP55能够直接识别并结合到MsSNAT1启动子的特定区域。
第六环节：MsBZIP55在耐盐性中的功能与遗传互作验证。 获得了MsBZIP55过表达（MsBZIP55-OE）和RNAi敲低（MsBZIP55-RNAi）的转基因苜蓿株系后，研究对其进行了系统的表型和生理分析。结果与MsSNAT1的研究形成了完美的遗传学互补：MsBZIP55-OE株系（表现为MsSNAT1表达和褪黑素水平降低）在盐胁迫下表现出叶片黄化卷曲加剧、MDA和H₂O₂含量升高、EL增加、抗氧化酶活性降低、Na⁺/K⁺比升高以及MsSOS1/MsNHX1表达下调等一系列盐敏感表型。相反，MsBIP55-RNAi株系（表现为MsSNAT1表达和褪黑素水平升高）则表现出与MsSNAT1-OE类似的强耐盐表型。更为关键的是，外源施加褪黑素能够有效缓解MsBZIP55-OE株系的盐敏感表型，使其生理指标（如叶绿素含量、EL、MDA）得到显著改善。这一“回补”实验强有力地证明，MsBZIP55-OE的盐敏感性确实是由于其介导的MsSNAT1表达抑制所导致的褪黑素合成减少造成的。
主要研究结果 本研究取得了一系列层次分明、相互印证的重要结果： 1. 成功鉴定并证实MsSNAT1是苜蓿褪黑素生物合成的正调控因子：该基因受盐胁迫诱导，其过表达能提高内生褪黑素水平，通过增强抗氧化系统（降低ROS、提高抗氧化酶活性）和改善离子稳态（降低Na⁺/K⁺比、上调MsSOS1/MsNHX1），显著提升苜蓿的耐盐性。反之，其敲低则导致耐盐性下降。 2. 通过多组学联合分析锁定上游调控因子MsBZIP55：结合转录组学、双荧光素酶报告系统和大规模转基因筛选，成功将碱性亮氨酸拉链（bZIP）家族转录因子MsBZIP55鉴定为MsSNAT1的潜在抑制子。 3. 提供直接证据证明MsBZIP55是MsSNAT1的转录抑制因子：EMSA和ChIP-qPCR实验从体外和体内层面共同证实，MsBZIP55蛋白能够直接结合到MsSNAT1启动子的G-box元件上，从而在转录水平抑制其表达，导致褪黑素合成减少。 4. 阐明MsBZIP55-MsSNAT1模块的遗传功能：遗传学证据表明，MsBZIP55过表达（功能获得）导致耐盐性下降，而其敲低（功能缺失）则增强耐盐性，且其表型与MsSNAT1的表达水平及褪黑素含量紧密相关，构成了一个清晰的“抑制-激活”调控级联。 5. 通过外源褪黑素回补实验确认了因果链条：外源施加褪黑素可以挽救MsBZIP55过表达植株的盐敏感表型，这直接证明了该表型是由于下游褪黑素合成受阻所致，而非MsBZIP55的其他未知靶基因造成，从而完整地闭合了从转录因子到表型的分子通路。
研究结论与价值 本研究得出结论：在苜蓿中，转录因子MsBZIP55受盐胁迫诱导表达后，直接结合到褪黑素生物合成限速酶基因MsSNAT1的启动子区，抑制其转录，从而减少褪黑素的合成。较低的褪黑素水平削弱了植物的抗氧化防御能力和离子稳态维持能力，最终导致苜蓿对盐胁迫的耐受性降低。反之，当MsBZIP55被抑制时，MsSNAT1表达上调，褪黑素积累增加，进而通过增强抗氧化系统和改善离子平衡来赋予植物更强的耐盐性。因此，MsBZIP55-MsSNAT1模块是苜蓿响应盐胁迫、调控褪黑素合成的关键枢纽。
该研究的科学价值在于：首次在苜蓿中系统解析了一个由bZIP转录因子负调控褪黑素合成进而影响耐盐性的完整信号通路，加深了我们对植物激素（褪黑素）生物合成转录调控机制的理解，为植物抗逆分子网络增添了新的重要环节。其应用价值则体现在：MsBZIP55和MsSNAT1可作为重要的分子育种靶标。通过基因编辑（如敲除MsBZIP55）或转基因（如过表达MsSNAT1）技术，有望培育出高褪黑素含量、高耐盐性的苜蓿新品种，这对于在盐渍化土地上扩大苜蓿种植、保障牧草供给和生态修复具有重要的实践意义。
研究亮点 本研究的亮点突出体现在以下几个方面： 1. 研究逻辑严谨，证据链完整：从表型观察到基因鉴定，再到上游调控因子的筛选、验证（体外、体内结合实验），最后通过正向（过表达）、反向（RNAi）遗传学以及化学回补实验进行功能确认，形成了一个无可辩驳的完整证据闭环。 2. 多技术平台整合运用：研究娴熟地综合运用了分子生物学（基因克隆、载体构建）、遗传转化、生理生化测定、组学技术（转录组RNA-seq）、分子互作检测（EMSA， ChIP-qPCR）、报告基因系统（双荧光素酶、GUS）等多种现代生物学研究手段。 3. 发现了一个新的负调控模块：与许多研究中转录因子正向调控抗逆基因的表达不同，本研究揭示了一个受胁迫诱导的转录因子（MsBZIP55）反而通过抑制有益代谢物（褪黑素）的合成基因来负调控耐盐性的独特模式，这为了解植物在胁迫下精细而复杂的调控网络提供了新视角。 4. 紧密联系生产实践：研究以重要的经济牧草苜蓿为材料，聚焦于生产上突出的盐害问题，其研究成果具有明确的转化潜力和应用前景，体现了基础研究与农业应用相结合的鲜明特色。
其他有价值内容 此外，论文中对实验方法的描述非常详尽，包括植物材料的培养条件、盐处理和褪黑素外施的具体方案、各种生理指标（叶绿素、电解质渗透率、抗氧化酶活性、离子含量、褪黑素含量）的标准化测定方法等，为同行重复和借鉴该研究提供了充分的技术细节。同时，作者将相关的基因序列数据公开在Figshare和NCBI GEO数据库中，体现了良好的科研数据共享规范。