研究报告

主要作者与发表信息

本研究由中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心的王钦涛、宫彦海、王连红、吕娜娜、杜雪峰、张佳顺、辛一、孙鲁阳、马波、王喜先和徐健等研究人员，联合德国波茨坦大学、法国艾克斯-马赛大学等国内外多家机构共同完成。其中王钦涛和宫彦海为共同第一作者，徐健、王喜先和马波为共同通讯作者。该研究成果于2026年发表在《自然·通讯》（Nature Communications）期刊上（DOI: 10.1038/s41467-026-74304-5）。

研究背景与目的

微藻作为单细胞光合生物，贡献了全球超过45%的年净初级生产力，且能合成蛋白质、脂类、多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素等高价值化合物，是极具潜力的“碳中和”细胞工厂。然而，微藻功能基因组学研究长期受制于一个核心瓶颈：缺乏能够在单细胞分辨率下高效关联基因型（Genotype）与代谢表型（Metabolic Phenotype）的方法。例如，在模式产油微藻微拟球藻（Nannochloropsis oceanica）中，超过50%的预测基因功能未知，这严重阻碍了对其代谢机制的解析和代谢工程的推进。传统的正向遗传学方法依赖物理、化学诱变或随机插入构建突变体库，存在突变位点多、鉴定费时费力且难以将表型明确归因于特定基因等局限。此外，基于荧光激活细胞分选（FACS）的表型筛选技术，常因需要繁琐的荧光标记或受限于细胞自身色素（如叶绿素）的荧光干扰而难以广泛应用。因此，本研究旨在建立一种全新的平台，该平台整合了全基因组单基因编辑突变体库和高通量拉曼激活细胞分选（RACS）技术，以实现快速、无标记地在单细胞层面解析基因型与代谢表型的关联，从而加速功能基因和调控通路的发现。

详细研究流程与实验方法

研究流程主要分为三大步骤：全基因组CRISPR/Cas突变体库的构建与验证、基于单细胞拉曼光谱的高通量表型筛选，以及对筛选到的关键基因进行体内功能验证和机制解析。

首先，研究团队以工业微藻微拟球藻为模式生物，构建了首个微藻全基因组单基因编辑突变体库。他们设计了一个基于tRNA的CRISPR/Cas系统，以克服传统核酶（如锤头状核酶）结构导致连接精确度低的问题。这一改良使得向导RNA（gRNA）与质粒的正确连接率提升至85%，且对测试基因的敲除效率达到100%。该gRNA文库包含9,709条gRNA，靶向约94%的蛋白编码序列。经过转化后，共获得5,760个转化子，并从中鉴定出3,567个突变株和2,397个有效的gRNA。通过高通量测序验证，该突变体库表现出高质量的覆盖度、高均匀性（基尼系数仅为0.04）和极高的突变效率（85.4%的突变为移码突变），且突变基因在基因组和功能类别中分布均匀，未显示出显著的核苷酸偏好性。

其次，研究团队利用自主研发的正介电泳-确定性侧向位移-拉曼激活细胞分选（pDEP-DLD-RACS）平台，对构建的全基因组突变体库进行高通量筛选。他们首先证实了单细胞拉曼光谱（SCRS）能够无标记、定量地检测微拟球藻细胞内的总类胡萝卜素含量，其特征峰（如~1509 cm⁻¹）强度与纯品浓度呈线性相关。该分选平台展现出卓越的稳定性（在5小时内信号稳定）和高分选性能（分选准确率高达95.97%，通量约600个细胞/分钟）。筛选实验分为两步：先是对突变体库和野生型的细胞群体进行SCRS采集，发现突变体库的SCRS异质性显著高于野生型，证实了库中存在类胡萝卜素含量升高的突变体。随后，研究团队进行了三次独立的RACS分选，筛选标准设为SCRS中1509 cm⁻¹峰强度最高的前1%细胞。通过比对分选前后细胞中的gRNA丰度，他们分别富集到40、44和56个基因，涉及类胡萝卜素合成、光合作用等逾20条通路。其中，有9个功能未知的基因在三次筛选中均被稳定地富集到。

最后，研究团队对筛选中发现的两个代表性基因——紫黄质脱环氧化酶（NoVDEs）和蛋白酶体组装伴侣4（NoPAC4）进行了深入的体内功能和机制验证。针对NoVDEs，他们通过一次转化同时敲除了微拟球藻中所有五个NoVDE基因，构建了五重敲除突变体。针对NoPAC4，则构建了独立的敲除突变体。通过在不同光照条件下培养，系统测定突变体的光合效率（Fv/Fm）、色素组成及含量，并结合RNA-seq转录组学分析，揭示了这些基因在类胡萝卜素代谢调控网络中的作用。

主要研究结果与逻辑关系

通过将高通量RACS与全基因组突变体库筛选相结合，研究取得了丰硕的成果。第一步的突变体库构建，为后续的无偏筛选提供了坚实、均质且基因型明确的物质基础。第二步的RACS筛选，成功地从数千个突变体中“大海捞针”般快速锁定了多个导致类胡萝卜素含量升高的已知和未知基因。例如，在三次独立筛选中均被高度富集的基因包括已知的类胡萝卜素代谢酶（如NoVDEs）和预期之外的全新调控因子（如NoPAC4），这表明该平台的灵敏度和高通量特性足以从全基因组范围内发现新功能基因。

针对紫黄质脱环氧化酶（NoVDEs）的验证结果表明，五重敲除突变体（novde-1和novde-2）在低光条件下，其紫黄质含量分别比野生型增加了30.3%和24.8%，β-胡萝卜素含量也显著提升，同时光合系统II最大量子产率（Fv/Fm）升高。这证实了NoVDE酶在催化紫黄质向玉米黄质转化过程中的关键作用，其敲除会导致紫黄素的积累和总类胡萝卜素含量的增加。对此前文献报道的单基因敲除无显著表型的差异，本结果突显了系统性敲除功能冗余基因家族的必要性。

针对蛋白酶体组装伴侣4（NoPAC4）的研究则揭示了一条全新的调控途径。在低光条件下，NoPAC4敲除突变体（nopac4-1和nopac4-2）的紫黄质、β-胡萝卜素和玉米黄质含量以及总类胡萝卜素含量均全面显著提升，生长速率和Fv/Fm也同步增加，完美复现了拉曼分选预测的表型。转录组分析进一步提示了两种可能的调控机制：（1）NoPAC4敲除导致组蛋白去乙酰化酶（HDAC）基因表达下调，暗示存在表观遗传调控机制；（2）NoPAC4敲除影响了26S蛋白酶体的组装活性，可能减弱了其对类胡萝卜素合成关键酶（如八氢番茄红素合酶PSY）前体蛋白的降解，促进了这些前体蛋白向叶绿体的转运，从而在翻译后水平上增强了类胡萝卜素的合成。

研究结论与价值

本研究成功建立并验证了一个结合全基因组CRISPR/Cas单基因编辑突变体库与高通量拉曼激活细胞分选（RACS）的正向遗传学平台。该平台首次在微藻中实现了以“无标记、高通量、单细胞”的方式，将特定代谢表型（高类胡萝卜素含量）快速、明确地追溯到其背后的单一基因型。通过该平台，研究不仅鉴定了已知的类胡萝卜素代谢酶（NoVDEs）的新功能，更发现了像NoPAC4这样的全新调控因子，并提出了其在转录后和翻译后水平调控类胡萝卜素合成的多层级模型。

该研究的科学价值在于提供了一种通用且高效的基因挖掘策略，极大地加速了功能未知基因的发现与通路解析，解决了功能基因组学中长期存在的瓶颈。其应用价值则体现在为微藻及其他生物（如细菌、真菌、植物甚至哺乳动物细胞）的代谢工程和合成生物学研究提供了强大的底盘工具。凭借RACS可检测的丰富代谢表型（如脂类、多糖等），该平台未来有望应用于系统性、多性状的基因挖掘，甚至直接从环境样本中筛选功能细胞。

研究亮点与创新性

该研究的亮点主要体现在三个方面：第一，方法的原创性与整合性，首次将高质量的tRNA-CRISPR全基因组突变体库与pDEP-DLD-RACS高通量、高稳定性单细胞分选技术联用，克服了传统基因筛选方法的局限性。第二，发现的新颖性，不仅验证了已知基因的新特性，更发现了NoPAC4-26S蛋白酶体这一前所未有的、调控光合色素合成的转录后/翻译后途径，拓展了26S蛋白酶体在植物色素合成领域的全新功能认知。第三，平台的广泛适用性，RACS作为一种无标记、非破坏性且信息丰富的单细胞分析技术，其对类胡萝卜素的精准定量分选不受叶绿素干扰，解决了FACS无法直接分选此类代谢物的难题，为其他难以标记的代谢物研究铺平了道路。