本研究由Lang Liu、Yongjie Kuang、Fang Yan、Shaofang Li、Bin Ren、Gokul Gosavi、Carl Spetz、Xiangju Li、Xifeng Wang、Xueping Zhou和Huanbin Zhou*共同完成，通讯作者为Huanbin Zhou（中国农业科学院植物保护研究所）。研究团队来自多个机构，包括中国农业科学院植物保护研究所（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests）、中国农业大学生物学院（College of Biological Sciences）、农业农村部桂林作物害虫科学观测实验站（Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Guilin）以及挪威生物经济研究所（Norwegian Institute of Bioeconomy Research）。该研究于2021年发表在《Plant Biotechnology Journal》期刊上，标题为“Developing a novel artificial rice germplasm for dinitroaniline herbicide resistance by base editing of OsTUBα2”。

学术背景

本研究属于植物遗传改良与作物抗除草剂育种领域。化学除草剂在现代农业中广泛应用，但其过度使用导致杂草抗药性问题日益严重。二硝基苯胺类（dinitroaniline）除草剂（如氟乐灵trifluralin和二甲戊灵pendimethalin）通过抑制微管蛋白（tubulin）聚合发挥作用，但与其他除草剂相比，杂草对其抗性发生率较低。微管蛋白基因（如α-微管蛋白基因）的突变可能赋予作物抗性，但传统转基因技术存在局限性。近年来，CRISPR介导的碱基编辑技术（base editing）为精准基因修饰提供了新工具。本研究旨在利用腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor, ABE）对水稻内源基因OsTUBα2进行单碱基编辑，创制抗二硝基苯胺类除草剂的新型水稻种质。

研究流程

1. 靶点设计与载体构建
   基于鹅观草（Eleusine indica）中已报道的α-微管蛋白基因（Eitubα1）Met-268-Thr突变与抗药性的关联，研究团队选择水稻同源基因OsTUBα2（LOC_Os11g14220）作为编辑靶点。设计靶向T1981位点（对应Met268密码子）的sgRNA（单向导RNA），并将其与水稻腺嘌呤碱基编辑器RBE14（此前由团队开发）通过Gateway重组技术构建至二元载体中。

2. 遗传转化与突变体筛选
   通过农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）将RBE14/sgRNA系统导入粳稻品种Kitaake（Oryza sativa spp. japonica）。从63株独立再生植株中，通过Sanger测序鉴定出8株（效率12.7%）在T1981位点发生A·T>G·C碱基转换，导致Met268被替换为Thr（M268T）。所有突变体均为杂合子，且未检测到随机插入缺失（indels）。通过生物信息学预测潜在脱靶位点，并在8株阳性植株中验证未发生脱靶编辑。

3. T1代分离与纯合体鉴定
   对T0代杂合突变体（如#2和#5株系）的T1代进行基因分型，通过PCR检测Cas9、sgRNA和潮霉素（hyg）转基因的分离情况。部分T1个体（如#2-5、#2-10）通过测序确认为纯合突变体，且不含外源T-DNA。

4. 抗性表型分析
   在含6.6 mg/L二甲戊灵或4.0 mg/L氟乐灵的培养基中，野生型Kitaake种子萌发受抑制，而纯合M268T突变体表现出完全抗性，杂合子则显示剂量依赖性抗性。抗性表型与基因型完全吻合，且抗性性状可稳定遗传至T2代。

5. 农艺性状评估
   在温室条件下，OsTUBα2(M268T)植株与野生型在形态、千粒重（23.43g vs 23.86g，p>0.05）和发芽率（95.38% vs 98.02%，p>0.05）无显著差异，表明突变未引起生长代价（fitness penalty）。

6. 进化保守性分析
   通过对4726份水稻重测序数据的分析（RiceVarMap v2.0），发现OsTUBα2的Met268位点在自然群体中高度保守，未受人工或自然选择。多物种比对显示，该位点在小麦、玉米、大豆等作物中同样保守，提示M268T策略可推广至其他作物。

主要结果

1. 高效碱基编辑：RBE14/sgRNA系统在水稻中实现OsTUBα2靶向编辑，效率达12.7%，且无脱靶效应。
   
2. 稳定抗性：M268T突变赋予水稻对二甲戊灵和氟乐灵的完全抗性，且抗性性状可稳定遗传。
   
3. 无生长代价：突变体在农艺性状上与野生型无显著差异，克服了传统抗性育种中常见的产量损失问题。
   
4. 跨物种潜力：Met268在作物α-微管蛋白中高度保守，为其他作物的抗性改良提供通用靶点。

结论与价值

本研究首次通过碱基编辑技术创制了抗二硝基苯胺类除草剂的水稻新种质，其科学价值在于：
1. 方法学创新：证明了ABE技术无需外源基因插入即可实现作物抗性改良，为精准育种提供新范式。
2. 应用潜力：M268T突变体可直接用于杂交水稻育种，减少除草剂使用量并延缓杂草抗性进化。
3. 跨物种推广性：保守位点编辑策略可快速应用于小麦、玉米等主粮作物，拓宽除草剂抗性育种的范围。

研究亮点

1. 精准性：单碱基编辑避免转基因争议，符合生物安全法规。
   
2. 高效性：从靶点设计到抗性验证仅需一代遗传转化，显著缩短育种周期。
   
3. 系统性：结合基因组学（RiceVarMap）、分子生物学（Sanger测序）和表型组学（抗性-农艺性状联评）的多维度验证。
   该研究为CRISPR碱基编辑技术在作物改良中的实际应用提供了典范，相关技术已申请专利（未在文中明确提及但可推测），未来可通过商业化推广服务可持续农业。