本研究由 Xin Jie Chen 和 G. Desmond Clark-Walker 完成，作者单位是澳大利亚国立大学生物科学研究院分子与群体遗传学组。该论文于 1993 年 3 月发表在 Genetics 杂志第 133 卷第 517–525 页，标题为《*Mutations in MGI genes convert Kluyveromyces lactis into a petite-positive yeast*》。论文通信编辑为 R. H. Davis。该研究属于酵母线粒体遗传学领域，重点探讨 petite 阴性酵母 Kluyveromyces lactis 在特定核基因突变后转变为 petite 阳性酵母的机制。

本研究的学术背景建立在一个长期存在的酵母遗传学问题之上。在以 *Saccharomyces cerevisiae*（酿酒酵母）为代表的 petite 阳性酵母中，线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）容易发生大片段缺失，从而产生呼吸缺陷型 petite 突变体。这些突变体虽然丧失呼吸能力，但仍能通过发酵在葡萄糖培养基上生长。相反，大多数酵母属于 petite 阴性酵母，它们既不自发产生大的 mtDNA 缺失，也不易在溴化乙锭（ethidium bromide，EBr）等 DNA 嵌入剂作用下丢失 mtDNA。此前对 petite 阴性现象的解释主要包括两类：一类认为这些酵母发酵能力不足，无法在缺乏呼吸作用时维持生长；另一类则认为其 mtDNA 结构或 mtDNA 代谢酶的特殊性阻止了缺失突变的产生。为了系统检验这些假说，作者选择了 K. lactis 作为模式生物，首先通过定向破坏其唯一的细胞色素 c 基因（*CYC1*）来验证该酵母是否能在无呼吸条件下仅靠发酵生长。这一实验设计旨在排除“发酵能力不足导致 petite 阴性”这一传统解释，并为后续分离线粒体基因组突变体提供理论前提。

在实验流程方面，研究首先构建了用于破坏 CYC1 基因的质粒 pCYC-URA3。该质粒以 pTZ19R 为基础，在 K. lactis CYC1 基因编码区的 HindIII 位点插入了来自 S. cerevisiae 的 URA3 基因。随后用 PacI 和 KpnI 酶切质粒，获得含有 URA3 基因且两侧为 CYC1 序列的 1.5 kb DNA 片段，并转化至两个 K. lactis 菌株中：一个是 *RAG+*、uraA1 菌株 PM6-7A，另一个是 *rag1*、*rag2*、uraA1 菌株 MW98-8C。PM6-7A 中获得 34 个 Ura+ 转化子，其中 6 个不能在甘油培养基上生长，且 Ura+ 表型高度稳定。MW98-8C 因发酵途径缺陷而依赖呼吸生长，未获得甘油阴性转化子。Southern 印迹杂交证实 URA3 正确插入染色体 CYC1 位点，使野生型 4.4 kb 的 BclI 片段变为 5.5 kb。四分子分析显示 URA+ 与甘油阴性表型在减数分裂中严格 2:2 共分离。进一步用携带 PHO5 启动子驱动的 CYC1 编码序列的质粒 pPHO-CYC1 转化 cyc1 破坏株 KG7/S，可恢复其在甘油上的生长能力。吸收光谱分析表明，野生型菌株具有细胞色素氧化酶、细胞色素 b 和细胞色素 c 的特征吸收峰，而 KG7/S 不仅缺失细胞色素 c 峰，还同时缺失细胞色素 *a*、a3 和 b 的吸收峰。这一结果表明 K. lactis 中细胞色素组分的合成或稳定性存在紧密偶联。

在确证 K. lactis 能在无细胞色素 c 介导呼吸作用的情况下发酵生长后，作者采用“生长边缘法”分离线粒体基因组突变体。该方法将细胞暴露于允许存活的最高浓度 EBr 中，在大量培养板上筛选甘油阴性突变体。研究共使用 72 个培养板，约 2×10⁶ 个细胞/板，最终获得 4 个甘油阴性突变体，分别为 WM52/Gly-2.10、WM52/Gly-2.9、WM52/Gly-23.4 和 WM52/Gly-3.9。通过 HaeIII 酶切和 Southern 印迹分析，发现前三个突变体完全缺失 mtDNA，而 WM52/Gly-3.9 含有一个发生缺失和重排的线粒体基因组。进一步遗传分析显示，WM52/Gly-2.10 携带一个单基因核突变，该突变被命名为 *mgi1-1*。该突变在四分子分析中呈 2:2 分离，且与 his7 和 uraA1 无连锁。WM52/Gly-23.4 携带的突变为 *mgi1-2*，与 mgi1-1 等位；WM52/Gly-2.9 携带的突变则定位于另一个基因座，称为 *mgi2-1*。等位性检验和互补分析表明，mgi1 与 mgi2 是两个不连锁的基因座。WM52/Gly-3.9 则不携带 mgi 核突变。

在表型分析中，携带 mgi 突变的单倍体菌株表现出与酿酒酵母相似的 petite 阳性特征。在含 1 μg/ml EBr 的 GYP 平板上，mgi1-1 菌株 CK22-13A 的 petite 形成率可达 100%，而野生型 MGI1 分离子在同一条件下不产生甘油阴性菌落。自发 petite 频率在 mgi 突变体中为 0.45%–5.68%，与酿酒酵母的自发 petite 频率范围相近。EBr 诱导的 petite 中约 50% 完全缺失 mtDNA，其余保留部分 mtDNA 片段。自发 petite 则均保留部分 mtDNA，表现为不同类型的缺失、重排或新片段扩增。杂合二倍体 mgi1-1/MGI1 在无 EBr 条件下不自发产生 petite，但在 EBr 处理下几乎全部转变为甘油阴性，说明 mgi 突变在自发 petite 形成方面呈隐性，但在 EBr 敏感性方面呈显性。

本研究的核心结论是，K. lactis 的 petite 阴性表型并非由于缺乏发酵能力，而是因为其核基因组中存在维持线粒体基因组完整性的 MGI 基因。MGI 基因突变后，K. lactis 可转变为 petite 阳性酵母，能够在 EBr 处理下高频丢失 mtDNA 或自发产生含缺失 mtDNA 的 petite 突变体。作者提出，MGI 基因产物可能参与维持 mtDNA 重组的忠实性，当这些基因发生突变时，非同源重组增加，尤其在 EBr 使 mtDNA 底物发生扭曲时更为明显。研究还提示，酿酒酵母等 petite 阳性酵母可能在自然演化中发生了 MGI 同源基因的改变。这一观点将 petite 阳性与 petite 阴性酵母之间的差异从生理层面提升到核基因控制线粒体基因组稳定性的层面。

本研究的亮点包括：首次通过定向破坏 CYC1 基因直接证明 K. lactis 可在无细胞色素 c 呼吸作用下仅靠发酵生长；利用高浓度 EBr 联合大量筛选成功分离出罕见的线粒体基因组突变体；发现并命名了 MGI1 和 MGI2 两个控制线粒体基因组完整性的新基因座；证明 mgi 突变可使 petite 阴性酵母转变为 petite 阳性表型。此外，研究中观察到 cyc1 破坏导致其他细胞色素同步缺失，提示 K. lactis 中线粒体呼吸链组分的合成或装配具有紧密调控关系。论文还提到，在稿件提交期间，Haffter 和 Fox 在 Schizosaccharomyces pombe 中也报道了类似功能的核突变 ptp1-1 和 *ptp2-1*，表明不同酵母中维持线粒体基因组完整性的机制可能具有进化上的保守性。这些发现为理解线粒体基因组稳定性、petite 突变形成机制以及酵母发酵与呼吸之间的遗传调控关系提供了重要依据。