本研究由Siyao Xia、Hao Wang、Xupeng Hong、Jianfei Lu、Dan Xu、Yousheng Jiang及Liqun Lu等人完成，其中Siyao Xia与Hao Wang为共同第一作者，通讯作者为Liqun Lu，其所属单位主要为上海海洋大学（Shanghai Ocean University）国家水生动物病原库（National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals）、淡水水产遗传资源农业部重点实验室（Key Laboratory of Agriculture Ministry for Freshwater Aquatic Genetic Resources）及渔业科学国家级实验教学示范中心（National Experimental Teaching Demonstration Center for Fishery Sciences），另有一位作者来自美国宾夕法尼亚州立大学医学院（College of Medicine, Pennsylvania State University）。该论文发表于Fish and Shellfish Immunology第76卷（2018年），页码为35–40，于2018年2月24日在线发表。

一、研究背景

鲫鱼（Crucian carp, *Carassius auratus gibelio*）是中国重要的淡水经济鱼类，年产量超过200万吨。然而，自2011年以来，鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2）成为导致鲫鱼高死亡率的首个病毒性病原，给养殖业造成严重损失。CyHV-2又称金鱼造血器官坏死病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus, HVHNV），属于疱疹病毒目鱼疱疹病毒科（Alloherpesviridae）中的鲤病毒属（Cyprinivirus），其病毒颗粒呈六边形核衣壳，直径约100–110 nm，完整病毒粒子具有囊膜，直径约175–200 nm。目前针对该病毒尚无有效的防控手段。

干扰素（Interferon, IFN）是一类具有广谱生物学活性的蛋白质，在抗病毒、抗肿瘤及免疫调节中发挥重要作用。干扰素系统被认为是宿主先天免疫中最早对病毒复制产生应答的细胞分子。虽然鱼类中干扰素样活性早有报道，但鱼类干扰素基因直到2003年才通过斑马鱼基因组测序和表达序列标签（EST）分析首次被克隆和鉴定。此后，越来越多的鱼类干扰素基因被发现和研究。I型干扰素（Type I IFN）基因在宿主细胞识别病毒核酸后被诱导表达，并通过局部或全身性保护作用对抗病毒感染。

为了解析CyHV-2感染通路及其关键相关基因，作者团队前期对感染CyHV-2的鲫鱼肾脏组织进行了转录组高通量测序分析，鉴定到一个部分干扰素转录本（comp11944_c1）在感染鱼肾脏中显著上调（FDR=0.2，p值=0.0062），提示该干扰素可能在鲫鱼抗CyHV-2免疫中发挥作用。然而，该干扰素的完整序列、结构特征、组织分布以及功能尚不清楚。因此，本研究旨在克隆并鉴定该干扰素基因，分析其在不同组织中的表达模式及其在CyHV-2感染后的动态变化，并通过体内过表达实验验证其抗病毒功能。

二、研究工作流程

本研究主要分为以下几个步骤：基因克隆与序列分析、组织表达谱分析、CyHV-2感染后时序表达分析、真核表达质粒构建与细胞表达验证、以及体内抗病毒功能评价。

首先，作者从感染CyHV-2的鲫鱼肾脏组织中提取总RNA，利用SMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech, USA）进行5′和3′快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE），以获得该干扰素基因的全长cDNA序列。根据已知的部分序列，使用Primer 5软件设计基因特异性引物（5′-RACE-ifnc-F1/F2和3′-RACE-ifnc-R1/R2），并与通用引物UPM和NUP组合进行PCR扩增。PCR条件为94 °C变性1分钟，随后以94 °C 30秒、68 °C 30秒、72 °C 2分钟进行25个循环，最后72 °C延伸10分钟。PCR产物经Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega, USA）纯化后，克隆至pMD19-T载体（Takara, Japan）并进行商业测序（Sangon Biotech, China）。获得的核苷酸序列通过BLAST算法和BioEdit软件进行编辑与分析，并利用MEGA 5.0程序中的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。

其次，为分析该干扰素基因在健康鲫鱼中的组织分布，作者采集了肌肉、脾脏、肝脏、鳃、脑和肠道等组织，提取RNA并进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。实验使用β-actin作为内参基因，采用2⁻ΔΔCt方法计算相对表达水平。

第三，为明确该干扰素基因在CyHV-2感染过程中的时空表达变化，实验选用体重约15 g的鲫鱼，在水温22–24 °C条件下驯化2周后进行攻毒实验。每尾鱼腹腔注射1×10⁶ TCID50的CyHV-2悬液，对照组注射等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。分别在注射后0小时、6小时、12小时、1天、2天和5天采集肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肠道、肌肉、脑和鳃等组织，用qRT-PCR测定干扰素基因转录水平。所有数据进行了单因素方差分析（one-way ANOVA）和配对样本t检验，p<0.05为差异具有统计学意义。

第四，为验证该干扰素蛋白能否在细胞中表达，作者将扩增的干扰素开放阅读框（ORF）插入真核表达载体pEGFP-N1的EcoRI和BamHI酶切位点之间，构建重组质粒pEGFP-ifnC。将该质粒转染HeLa细胞，48小时后通过荧光显微镜观察GFP融合蛋白的表达与亚细胞定位，并收集细胞裂解液进行Western blot分析，使用GFP特异性小鼠单克隆抗体（mAb）验证重组蛋白的表达。

第五，为研究该干扰素在体内的抗病毒功能，作者将纯化的pEGFP-ifnC质粒DNA以肌肉注射方式注入鲫鱼背鳍下方约0.5 cm处，剂量为50 μg质粒溶于100 μL PBS（pH 7.4），对照组注射等量pEGFP-N1空载体。质粒注射48小时后，以1×10⁶ TCID50的CyHV-2腹腔攻毒。在攻毒后1、2、4、7和14天分别采集肌肉和肾脏组织，利用qRT-PCR检测干扰素表达水平及病毒DNA拷贝数，同时统计各组鲫鱼的累计死亡率。此外，在质粒注射后第8天取注射部位肌肉组织，通过Western blot验证干扰素融合蛋白在鱼体内的表达情况。病毒DNA提取使用天根（Tiangen, China）DNA提取试剂盒，总DNA浓度用NanoDrop2000分光光度计测定。qRT-PCR使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad, USA），CyHV-2特异性引物为CyHV-2F/2R，扩增条件为95 °C 30秒，然后进行40个循环的95 °C 5秒、55 °C 30秒、95 °C 1分钟、65 °C 1分钟，并通过熔解曲线分析确认单一产物。

三、主要研究结果

通过RACE技术，作者获得了鲫鱼干扰素全长cDNA序列，将其命名为ccIFNc（crucian carp IFNc）。ccIFNc的开放阅读框全长546 bp，编码182个氨基酸的多肽（GenBank登录号：bankit2033924）。多重序列比对显示ccIFNc与I型干扰素共有序列的同源性为32.47%，BLAST分析显示其与斑马鱼IFN3（Danio rerio IFNα-like，CAM33457.1）具有92%的同源性。系统发育分析表明，ccIFNc与鲫鱼IFNc（AAR20886）、斑马鱼IFN3和斑马鱼IFN2（CAM33456.1）聚为一支，因此确定ccIFNc属于IFNα样I型干扰素。Expasy数据库预测该蛋白的理论等电点（pI）为5.08，总平均亲水性（GRAVY）为−0.155。

组织表达分析显示，ccIFNc在健康鲫鱼的肌肉、脾脏、肝脏、鳃、脑和肠道等组织中均有组成性表达，其中脾脏中表达水平最高，其次是肾脏、肌肉和鳃。在CyHV-2腹腔攻毒后，ccIFNc转录水平在大多数被测组织中显著上调，尤其在脾脏和鳃中上调幅度最大，分别达到对照组的436倍和158倍。在脾脏、肾脏和鳃中，ccIFNc的表达在攻毒后5天内达到峰值；而在肠道中，最高mRNA水平出现在攻毒后2天。肌肉、脾脏、鳃、肠道、肾脏和脑中的ccIFNc均被CyHV-2显著诱导，而肝脏中未观察到明显变化。

在细胞表达实验中，荧光显微镜观察显示ccIFNc-GFP融合蛋白在HeLa细胞中成功表达，并同时定位于细胞质和细胞核。Western blot分析进一步证实了该融合蛋白的表达。

在体内抗病毒功能实验中，肌肉注射pEGFP-ifnC质粒后，ccIFNc在肾脏和肌肉组织中的表达显著升高，并在注射后4天达到峰值，分别为对照组的5倍和15倍。Western blot证实了注射后第8天ccIFNc-GFP融合蛋白在鲫鱼肌肉组织中的表达。在CyHV-2攻毒后，对照组鱼体内病毒DNA拷贝数从0天的10²⁻³ copies/mL迅速上升，至4天时达到10⁶ copies/mL，并一直维持在该水平直到14天；而过表达ccIFNc的鲫鱼体内病毒DNA拷贝数仅最高增加至10⁵ copies/mL，病毒复制效率显著降低。此外，过表达ccIFNc的鲫鱼累计死亡率较对照组降低了约30%，并且死亡时间也有所延迟。

四、研究结论与意义

本研究首次从鲫鱼中克隆并鉴定了一个I型干扰素基因ccIFNc，证实其属于IFNα样I型干扰素，且在CyHV-2感染后显著上调，尤其在脾脏和鳃中表现出强烈的诱导表达。体内过表达实验表明，ccIFNc能够显著抑制CyHV-2复制并降低感染鲫鱼的死亡率，说明ccIFNc是一种具有抗病毒功能的关键细胞因子。该研究为揭示鱼类干扰素抗病毒免疫的分子机制提供了基础，同时也为通过遗传育种筛选抗病鲫鱼品系提供了潜在的分子靶标。鉴于目前尚无有效防控CyHV-2的手段，ccIFNc的发现对于开发抗CyHV-2的免疫防治策略具有重要的理论和应用价值。

五、研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，首次在鲫鱼中克隆并鉴定了I型干扰素ccIFNc，丰富了鱼类干扰素基因家族的研究；第二，通过转录组分析结合RACE技术，成功从病毒刺激的组织中鉴定出差异表达的干扰素基因；第三，通过体内过表达实验直接验证了ccIFNc对CyHV-2复制的抑制作用和降低死亡率的效果，提供了功能性证据；第四，研究结果为鲫鱼抗病毒免疫机制研究提供了新的分子靶点，并为抗病育种和疾病防治提供了科学依据。