一项发表于 2018年8月1日，由 Shakked O. Halperin、Connor J. Tou、Eric B. Wong、Cyrus Modavi、David V. Schaffer 及 John E. Dueber 等研究人员在 Nature 期刊上发表的题为《CRISPR-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window》的研究，介绍了一种名为 EvolvR 的新型基因多样化系统。该研究主要由 加州大学伯克利分校 及其下属的 创新基因组学研究所 等机构完成。
一、 研究背景与目标
在生物学研究与应用中，通过多样化遗传密码来理解和改造生物系统至关重要。传统的正向遗传学方法，虽然能模拟自然进化，但依赖在目标位点高效整合寡核苷酸库，操作是离散的。现有的靶向连续多样化技术存在显著局限，例如，只能在特定细胞、严苛培养条件下进行，或仅能突变特定类型的核苷酸，且窗口狭窄。因此，在用户定义的基因组区域内，实现对所有核苷酸的连续多样化，一直是一项未被满足的技术需求。
本研究旨在开发一种名为 EvolvR 的系统，该系统能够在用户指定的基因组位点，于一个可调节长度的窗口内，连续多样化所有类型的核苷酸，从而突破现有技术的瓶颈，为基础研究和生物技术应用提供强大的正向遗传学工具。
二、 研究工作流程与具体方法
研究团队设计并验证了EvolvR系统，其核心思想是利用 CRISPR 引导的切口酶将易出错的 DNA 聚合酶招募到特定基因组位点，通过聚合酶的合成作用和替换下游核苷酸来制造突变。具体研究流程分为以下几个层面：
EvolvR系统的设计与初步验证： 研究人员首先将来自化脓链球菌的 Cas9 切口酶（nCas9 (D10A)）与大肠杆菌 DNA 聚合酶 I（PolI）的低保真变体 PolI3M（含D424A, I709N, A759R突变）进行融合。将该融合蛋白与向导 RNA（gRNA）在质粒 pEvolvR 上表达，靶向另一个质粒上的特定序列。经过24小时培养后，高通量扩增子测序证实，在切口位点下游约17个核苷酸的窗口内产生了所有四种核苷酸的替换，窗口大小与 PolI 的持续合成能力一致。对照实验表明，只有当 nCas9 与 PolI3M 融合表达且使用靶向目标位点的 gRNA 时，才会出现高效突变，证实了该系统的部件都是必需的。波动分析实验（fluctuation analysis）则精确量化了突变率，结果显示，nCas9-PolI3M 使目标位点的突变率较野生型细胞提高了24,500倍，而全基因组突变率（global mutation rate）仅提高了120倍。
系统的模块化优化与性能调谐： 研究证明了EvolvR系统的模块化特性，使其性能可通过替换不同组件来调节。在 亲和力（affinity）调谐方面，通过在 nCas9 中引入三个能降低非特异性 DNA 亲和力的突变（K848A, K1003A, R1060A），构建了增强型切口酶 enCas9。enCas9-PolI3M 融合体在目标位点的突变率较野生型提高了21.2万倍，是 nCas9-PolI3M 的8.7倍，且特异性更高。在 保真度（fidelity）调谐方面，通过比较 enCas9 与一系列低保真 PolI 变体（PolI1M, PolI2M, PolI3M）的融合蛋白，证实了突变率随聚合酶保真度降低而提高。研究团队进一步筛选 PolI3M 的额外突变，发现增加了 F742Y 和 P796H 突变的 PolI5M 变体在切口处一个核苷酸位点的突变率达到了野生型的777万倍，是 PolI3M 的33倍，这是迄今为止报道的错误率最高的 PolI 突变体。
编辑窗口长度的扩展： 为扩大编辑窗口，团队采用了两种策略。其一，将 PolI5M 替换为更具持续合成能力的噬菌体 phi29 DNA 聚合酶。虽然 phi29 变体实现了在切口位点下游56和347个核苷酸处的靶向突变，但突变率远不及 PolI3M。其二，更成功的策略是增加 PolI 的持续合成能力。通过将噬菌体 T7 DNA 聚合酶的硫氧还蛋白结合域（TBD）插入 PolI3M 的拇指结构域，构建了 enCas9-PolI3M-TBD。此变体在距离切口56个核苷酸处的靶向突变率比全基因组突变率高出555倍，而原始 enCas9-PolI3M 在此距离已无靶向突变活性。通过靶向同时含有两个无义突变的基因，证实了 EvolvR 能在单个 gRNA 引导下产生组合突变。
降低脱靶效应与系统应用拓展： 针对由游离聚合酶引发的脱靶突变风险，团队通过密码子优化（codon-optimization），去除了 enCas9-PolI3M-TBD 编码序列中三个强烈的内部核糖体结合位点，得到 enCas9-PolI3M-TBD-co 变体，成功将脱靶突变率降低了4.14倍，而靶向突变率仅下降1.23倍。在应用层面，研究证实 EvolvR 可与荧光激活细胞分选（FACS）等非选择性筛选方法结合，成功从靶向含有提前终止密码子的绿色荧光蛋白基因的群体中，分选到恢复荧光的细胞。更重要的是，通过靶向大肠杆菌内源的核糖体蛋白基因 rpsE 和 rpsL，EvolvR 能在染色体上产生功能获得性突变，分别赋予细菌对奇霉素（spectinomycin）和链霉素（streptomycin）的抗性，证明了其编辑内源基因组的能力。共表达靶向这两个基因的 gRNA，成功实现了多个基因组位点的同时多样化。
三、 主要研究结果
研究结果系统展示了EvolvR技术的优越性能。首先，从概念上验证了“CRISPR引导的DNA聚合酶”这一设计可以产生靶向连续突变。通过对各组件（Cas9亲和力、聚合酶保真度与持续合成能力）的独立优化，实现了对突变率（最高达野生型777万倍）和编辑窗口长度（最长可达350个核苷酸）的广泛调谐。关键的量化数据来自波动分析，该方法精确测定了每个变体的靶向突变率和全基因组突变率，并理清了两者关系。例如，enCas9-PolI3M-TBD 变体在距离切口56bp处还能维持高效的靶向突变，而插入TBD结构域是其关键。在应用层面的重要结果是，EvolvR 不仅能在染色体上高效产生抗生素抗性突变（针对rpsE基因时，抗性细胞比例提高了约16,000倍），还展示了多重基因同时编辑的能力。最终，利用其连续多样化能力，在液体培养基中通过“突变-筛选-扩增”的连续循环，成功进化出了同时对两种抗生素耐药的大肠杆菌。此外，利用 EvolvR 对 rpsE 基因进行深度突变扫描，不仅产生了所有12种碱基替换和缺失，还发现了多个先前未知的奇霉素抗性相关突变，其机制可能是破坏了关键赖氨酸残基（Lys26）与抗生素间的氢键。
四、 研究结论、意义与亮点
该研究成功开发了EvolvR，这是首个能在用户自定义基因组位点上，对所有核苷酸进行连续多样化的系统。其科学价值在于为正向遗传学提供了前所未有的工具，尤其适用于那些无法高效进行同源定向修复整合的生物系统。在应用上，它能极大地加速工业微生物的进化育种、蛋白质结构功能研究、非编码基因组功能探索，以及用于细胞谱系追踪。研究的核心亮点在于其模块化设计理念，通过更换切口酶或聚合酶变体，可以对突变率和窗口长度进行精密的独立调控，堪称一套“可定制的分子进化工具箱”。该技术不仅无严重的细胞毒性，还能进行多重位点编辑，并通过连续定向进化，以最小的操作者干预实现复杂表型的进化，展现了强大的实际应用潜力。